组织工程人后板层半角膜体外构建的实验研究

摘要

角膜(Cornea)是位于眼球表面的一层透明组织，是维持正常视功能的重要结构，由于位于眼表的最外层，因而极易受到损伤和感染，致使角膜病是引起视力下降甚至致盲的主要因素，目前主要依赖于角膜移植手术进行治疗。据流行病学调查显示，我国现有角膜病盲患者300余万，均需要通过角膜移植进行治疗，但因捐献角膜数量有限和供体角膜老化，每年能接受手术治疗的患者只有1000余人，绝大多数患者因得不到可用的供体角膜而无法接受角膜移植和复明。目前，体外构建的组织工程角膜(Tissue-engineered human cornea)作为捐献角膜的替代物，是解决供体角膜匮乏的主要途径，已成为众多角膜病盲患者重见光明的希望。组织工程角膜体外构建的核心要素是种子细胞(Seeder cells)、载体支架（Carrier scaffold）和信号分子(Signalingmolecules)。组织工程角膜的体外构建，要求种子细胞必须能够持续保持细胞固有的形态结构、旺盛的增殖能力、稳定的遗传性能和发挥固有功能的潜能，要求载体支架必须具有与天然角膜类似的光学性能、三维网架结构、生物相容性和机械强度。获得足量正常的种子细胞和生物相容性理想的的载体支架是开展组织工程角膜体外构建研究的前提条件。
　　人角膜在组织结构上由上皮层(Epithelium)、前弹力层(Bowman's membrane)、基质层(Stroma)、后弹力层(Descemet' membrane)和内皮层(Endothelium)构成。其中，人角膜基质(Human cornea stroma，HCS)由交错排列的200-250个胶原板层结构和散在分布的HCS细胞组成，占角膜厚度的90％，在角膜厚度和透明度维持中具有关键作用;而人角膜内皮(Human cornea endothelium，HCE)位于角膜最内层、由连接紧密的单层HCE细胞镶嵌而成，是角膜和前房的天然屏障，通过泵-漏机制维持角膜透明度并为角膜供养/氧，在角膜厚度和透明度维持中具有决定性作用。在角膜受到深度创伤和感染时，往往会伤及深层HCS和HCE，即后板层半角膜，轻者引起角膜水肿和角膜内皮失代偿，重者甚至致盲。目前后板层半角膜的治疗方法主要是通过单层HCS和HCE的多次角膜移植手术，不仅增加了手术创伤和感染的风险，而且在角膜愈合和移植瘢痕残留方面也存在有诸多缺陷。因此，体外构建出可用于移植的组织工程人后板层半角膜(Tissue-engineered posterior hemicornea，TE-pHC)已成为学者们新的研究热点。本文研究目的就是利用本实验室自主建立的非转染、无致瘤性的HCE细胞系和HCS细胞系作为种子细胞，以带后弹力层的脱细胞猪角膜基质(acellular porcine cornealstromata with Descemet' membrane，aPCS-DM)为载体支架，进行TE-pHC的体外构建研究，旨在获得与活体角膜后半层组织结构高度近似的TE-pHC。
　　为了获得足量正常的TE-pHC种子细胞，本文首先对非转染无致瘤性HCS和HCE组织细胞系细胞进行了体外扩增培养，并对其形态结构、增殖活性、染色体属性以及细胞标志蛋白和功能蛋白的表达进行了鉴定。光镜观察结果发现，体外扩增培养的第1批65代HCE细胞形成汇合单层时呈多角形的六边形内皮样细胞形态，第28批63代HCS细胞形态呈梭型，仍然具有其原有细胞的形态特征;生长与增殖活性的检测结果显示，HCE细胞和HCS细胞的群体倍增时间分别为48.54 h和38.28 h，仍保持有旺盛的体外增殖能力;染色体组型分析结果发现，这两种细胞的特征性染色体数目均为2n=46条，仍具有人类染色体的特征;免疫细胞化学检测结果显示，HCE细胞和HCS细胞仍分别保持有HCE细胞标志蛋白——人血管内皮生长因子受体-2(FLK-1)和HCS细胞标志蛋白——波形蛋白的阳性表达，表明两种细胞仍保持有HCE细胞和HCS细胞的固有属性。对HCE细胞和HCS细胞功能蛋白的免疫细胞化学检测结果发现，HCE细胞仍保持有细胞连接形成蛋白——紧密连接蛋白1(ZO-1)、间隙连接蛋白-43(CX-43)和整联蛋白αv/β5以及膜运输蛋白——Na+/K+-ATPase的阳性表达，而HCS细胞保持有CX-43和整联蛋白β1以及Na+/K+-ATPase和乙醛脱氢酶3(ALDH3)的阳性表达，证明这两种细胞均仍然保持有形成细胞-细胞间、细胞-细胞外基质间细胞连接和执行膜运输功能的潜能，且HCS细胞保持有抗紫外损伤的潜能。上述鉴定结果证明，第65代HCE细胞和第63代HCS细胞在体外扩增培养中的形态、染色体属性和细胞属性正常，增殖能力旺盛，并依然保持有形成细胞连接和执行膜运输功能的潜能，符合作为组织工程角膜种子细胞的各项条件，可以被用于TE-pHC体外构建的种子细胞。
　　为了获得形态结构与天然角膜类似的TE-pHC载体支架，本文以新鲜猪角膜为材料进行了aPCS-DM支架的制备和鉴定。我们利用冻融循环联合核酸酶消化的方法进行脱细胞处理，经核黄素交联及风干处理，获得了aPCS-DM载体支架。用于构建TE-pHC前，分别对光学性能、组织结构、理化性质和机械性能进行了检测和评价。光学性能检测结果显示，aPCS的透明度和透光率近似于天然角膜，具有良好的光学性能。组织学检查结果显示，经过脱细胞处理后aPCS胶原板层仍保持排列规则且结构致密，后弹力层完整且表面平整，异种细胞在处理过程中被去除;理化性质检测结果显示，含水量略高于天然角膜，aPCS中DNA残留量低且符合医用生物材料标准，糖胺聚糖分布与天然角膜相似。生物力学性能检测结果显示，aPCS在生物力学性能上与天然角膜无显著差异。上述结果表明，本文制备的aPCS-DM支架具有良好的光学性能，三维组织结构和理化性质与天然角膜高度近似，生物力学性能优良，满足作为构建TE-pHC的载体支架材料的要求。
　　为了进一步检测载体支架与两种细胞的生物相容性，本文对aPCS支架进行了细胞毒性评价和接种细胞后的免疫组织化学检测。利用HCE细胞和HCS细胞进行MTT细胞毒性的检测结果显示，制备的aPCS无细胞毒性作用。接种HCS细胞和HCE细胞后aPCS的的免疫组织化学结果显示，细胞在载体支架内部和后弹力层表面均能阳性表达其标志蛋白、连接形成蛋白和功能蛋白。上述结果综合表明，aPCS支架不仅无细胞毒性，还能够为细胞的黏附、增殖和功能表达提供合适的三维空间结构，具备良好的生物相容性，是作为TE-pHC体外构建的理想支架材料。
　　在已获得种子细胞和载体支架的前提下，为了构建具有功能的TE-pHC，本实验进行了TE-pHC的体外构建并对其进行了鉴定。本文通过比较HCE细胞和HCS细胞的不同接种方式和摸索细胞接种时间建立了TE-pHC的构建技术路线:微量注射的方法将HCS细胞接种于aPCS支架的基质中，培养24 h后将接种过HCS细胞的植片后弹力层面向上直接法接种HCE细胞，继续培养至4天，从而构建出TE-pHC。对TE-pHC进行组织结构和功能检查，茜素红染色结果说明HCE细胞在后弹力层面形成连续的单层，细胞密度为2910±420个/mm2的密度，相当于健康成人30岁左右的内皮细胞密度;H&E染色结果显示HCS细胞在注射点附近支架黏附并伸展，向周围扩散分布，HCE细胞连续完整单层与后弹力层结合紧密;TE-pHC的电镜结果显示，HCE细胞在aPCS后弹力层上形成的单层细胞表面平整，细胞与细胞连接紧密，两种细胞与支架材料间均形成连接结构。免疫组织化学检测结果显示构建的TE-pHC中HCE细胞和HCS细胞标志蛋白、连接形成蛋白和功能蛋白表达均呈阳性。上述结果表明构建的TE-pHC在组织结构上近似于人角膜后板层，HCE细胞和HCS细胞功能蛋白正常表达，具有发挥后板层生物学功能的潜能。
　　综上所述，本文利用在体外扩增培养中的形态、染色体属性和细胞属性正常，增殖能力旺盛的非转染HCE细胞和HCS细胞，以光学性能优良，组织结构和理化性质与天然角膜高度近似，生物相容性和机械力学性能良好的aPCS-DM为载体支架，经体外构建5天后即可获得形态组织结构和生物学性能与活体角膜后板层高度近似的TE-pHC，具有发挥其生物学功能的潜能。这些研究结果表明本实验在体外成功构建的TE-pHC，既可作为体外角膜实验的良好模型，又兼具后板层半角膜移植等效替代物的应用前景。TE-pHC体外构建技术的建立及形态结构正常TE-pHC的获得，为其替代捐献角膜用于后板层角膜异常病变的临床治疗创造条件，也可替代组织工程人全层角膜用于角膜缘完好的全层角膜异常患者的穿透性板层移植，不仅科学意义重大，社会意义和应用价值重大，为组织工程角膜的临床应用奠定了体外实验基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 角膜基本结构

1．1 角膜上皮层

1．2 角膜前弹力层

1．3 角膜基质层

1．4 角膜后弹力层

1．5 角膜内皮层

2 组织工程角膜概述

3 组织工程角膜种子细胞的研究概述

3．1 原代或传代细胞

3．2 成体干细胞

3．3 胚胎干细胞

3．4 永生化细胞系

4 组织工程角膜载体支架的研究概述

4．1 天然材料

4．2 生物大分子材料

4．3 人工合成高分子材料

4．4 细胞片技术

5 脱细胞角膜在组织工程角膜中的应用

5．1 脱细胞方法

5．2 脱细胞角膜在组织工程角膜构建中的应用

6 本文研究目的及意义

第二章 人角膜内皮细胞和基质细胞的扩增培养及其鉴定

1 材料与用品

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 实验试剂

1．4 主要溶液配制

2 实验方法

2．1 HCE细胞和HCS细胞的复苏和体外扩增培养

2．2 HCE细胞和HCS细胞的生长特性测定

2．3 HCE细胞和HCS细胞的染色体组型分析

2．4 HCE细胞和HCS细胞的免疫化学检测

2．5 统计学分析

3 结果

3．1 HCE细胞的形态观察

3．2 HCE细胞和HCS细胞生长特性

3．3 HCE细胞和HCS细胞的染色体核型分析

3．4 HCE细胞和HCS细胞相关蛋白的表达

4 讨论

5 本章小结

第三章 脱细胞猪角膜基质支架的制备及鉴定

1 材料与用品

1．1 实验材料

1．2 主要仪器

1．3 实验试剂

1．4 主要溶液配制

2 实验方法

2．1 脱细胞猪角膜基质支架的制备

2．2 脱细胞猪角膜基质光学性能检查

2．3 脱细胞猪角膜基质组织结构学检查

2．4 脱细胞猪角膜基质成分分析

2．5 脱细胞猪角膜基质生物力学性能测试

2．6 统计学分析

3 结果

3．1 脱细胞猪角膜基质的理化性质鉴定

3．2 脱细胞猪角膜基质的组织结构检查

3．3 脱细胞猪角膜基质的成分

3．4 脱细胞猪角膜基质的生物力学检查结果

4 讨论

5 本章小结

第四章 脱细胞猪角膜基质支架的生物相容性研究

1 材料与用品

1．1 实验材料

1．2 主要仪器

1．3 实验试剂

1．4 主要溶液配制

2 实验方法

2．1 aPCS浸提液对HCE细胞及HCS细胞毒性检测

2．2 接种于aPCS支架上的HCE细胞及HCS细胞免疫化学检测

2．3 统计学分析

3 结果

3．1 aPCS浸提液对HCE细胞及HCS细胞活力影响作用分析

3．2 接种于aPCS支架的HCE细胞及HCS细胞属性和功能蛋白表达

4 讨论

5 本章小结

第五章 体外构建组织工程人角膜后板层的实验研究

1 材料与用品

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 实验试剂

1．4 主要试剂配制

2 实验方法

2．1 组织工程人后板层半角膜接种HCE细胞条件摸索

2．2 组织工程人后板层半角膜接种HCS细胞条件摸索

2．3 组织工程人后板层半角膜的体外构建

2．4 体外构建组织工程人后板层半角膜的鉴定

2．5 统计学方法

3 结果

3．1 aPCS接种HCE细胞的摸索

3．2 aPCS接种HCS细胞的摸索

3．3 体外构建TE-pHC的鉴定

4 讨论

5 本章小结

全文总结

参考文献

致谢

个人简历

在校期间发表论文