六神丸抗肺癌血管生成及信号转导途径的实验及临床研究

摘要

目的:通过体外实验观察六神丸含药血清对人肺癌A549细胞增殖、凋亡、细胞形态、生长状态、VEGF和VEGFmRNA、K-RAS、ERK1、ERK2、p-ERK蛋白表达的影响,K-RAS、ERK1、ERK2、p-ERK蛋白表达与VEGF表达的相关性,临床观察六神丸联合化疗治疗未经任何治疗ⅢB-IV期或不能手术ⅢA期肺癌患者的临床疗效和血清CEA、CYFRA21-1、VEGF的变化,探讨六神丸抗血管生成是否通过激活Ras→Raf→MEK→MAPK信号转导途径及血清VEGF是否可作为临床观察疗效指标之一。方法:1.实验研究采用体外培养人肺癌A549细胞,以不同浓度六神丸含药血清与A549共同孵育并分组观察,MTT法检测六神丸含药血清对人肺癌细胞系A549的增殖、光学显微镜下观察细胞形态、倒置相差显微镜下观察生长状态、流式细胞仪检测六神丸含药血清对细胞凋亡的影响、免疫细胞化学法测定VEGF、K-RAS、ERK1、ERK2、p-ERK蛋白表达情况,逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测VEGFmRNA的影响。2.临床研究观察六神丸联合化疗及化疗组对非小细胞肺癌患者的临床疗效及血清CEA、CYFRA21-1、VEGF表达水平的影响。全部病例均来自山东中医药大学附属医院,2009年12月至2011年12月肿瘤内科住院病人。制定病例纳入标准,纳入研究病人60例,随机分为观察组30例,对照组30例,对照组采用TP化疗方案,观察组在化疗的同时及化疗期间,同时给予六神丸。收集所有患者治疗前及治疗两周期后外周血5ml,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测VEGF水平,放射免疫分析法检测CYFRA21-1、CEA表达水平,观察治疗前后的临床疗效。结果:1.实验研究(1)六神丸含药血清对体外培养A549细胞具有明显细胞毒作用,且随着含药血清浓度的增加OD值逐渐降低,有显著性差异。(2)各含药血清组均可破坏人肺癌A549细胞的正常形态,阻碍其增殖生长;六神丸含药血清对人肺癌A549细胞的增殖抑制作用与含药血清的浓度呈正相关;六神丸与DDP联合用药有协同作用。(3)各含药鼠血清组、DDP单药组以及DDP+10％含药鼠血清组的早期凋亡率明显高于对照组;随着含药浓度的不断升高,早期凋亡率也明显增加;联合组的早期凋亡率明显高于各含药鼠血清组和DDP单药组。(4)各含药鼠血清组、DDP单药组以及DDP+10%含药鼠血清组的VEGF、ERK1、ERK2、p-ERK、K-RAS表达量及VEGFmRNA相对表达量均明显低于10%胎牛血清组,有显著性差异;与药物浓度呈负比。(5)统计结果显示六神丸含药血清对A549细胞降低VEGF的表达与其对ERK-1、ERK-2、p-ERK、K-ras表达的影响呈显著正相关(r=0.887,0.835,0.952,0.866)。2.临床研究(1)两组化疗完成情况:观察组2周期化疗完成率93.3%(28/30),高于对照组86.7%(26/30);(2)近期客观疗效:经χ2检验,两组有效率和病灶稳定率比较均无显著性差异;(3)两组治疗前后血清VEGF、CEA、CYFRA21-1水平的比较:两组治疗后VEGF、CEA、CYFRA21-1表达水平均较治疗前明显下降;与对照组相比,观察组VEGF、CEA表达水平更低,幅度下降更大,具有显著统计学差异。与对照组相比,观察组CYFRA21-1表达水平更低,但两组比较无统计学差异。(4)两组患者血清CEA、CYFRA21-1水平与VEGF水平行相关性分析:结果呈明显正相关(r=0.399、0.275,P＜0.01)。结论:六神丸通过抑制Ras→Raf→MEK→MAPK信号转导途径降低肺癌A549细胞VEGF蛋白的表达从而发挥抗血管生成的作用,具有抑制肺癌A549细胞生长、促进凋亡的作用,可降低肺癌患者血清VEGF的水平,同时六神丸联合化疗效果更好,二者具有协同作用。临床联合检测肺癌患者血清VEGF、CEA、CYFRA21-1的变化具有观察疗效及监测病情的作用。

目录

提要

Abstract

引言

实验研究

1 一般材料与含药血清的制备

1.1 实验材料

1.2 含药血清的制备

2 细胞培养

2.1 细胞培养方法

2.2 细胞悬液的制备

3 统计学方法

实验一 MTT 法检测六神丸含药血清对人肺癌 A549 细胞的细胞毒作用

实验二 六神丸含药血清对人肺癌 A549 细胞的形态学及生长状态的影响

实验三 流式细胞仪检测六神丸含药血清对人肺癌 A549 细胞凋亡的影响

实验四 六神丸含药血清对人非小细胞肺癌 A549 VEGF 及 VEGFmRNA 的影响

实验五 免疫组化法检测六神丸含药血清对人肺癌 A549 细胞 ERK1、ERK2、p-ERK、K-RAS 蛋白表达的影响

实验六 六神丸含药血清降低A549细胞VEGF表达与ERK-1、ERK-2、p-ERK、K-RAS 表达的相关性研究

临床研究

1 临床资料

1.1 病例来源

1.2 非小细胞肺癌的分期

1.3 病例选择标准

2 一般临床资料

3 治疗方法

4 观察指标和方法

4.1 治疗前后肿瘤病灶变化

4.2 治疗前后肿瘤标志物 CEA、CYFRA21-1 的变化

4.3 治疗前后血清 VEGF 表达水平的变化

4.4 实体瘤客观疗效评定标准

5 注意事项

6 统计学方法

7 结果

7.1 两组化疗完成情况

7.2 近期客观疗效

7.3 两组治疗前后血清 VEGF、CEA、CYFRA21-1 水平的比较

7.4 两组患者血清 CEA、CYFRA21-1 水平与 VEGF 行相关性分析

讨论

1 VEGF 与恶性肿瘤血管的生成及肺癌的相关性

2 K-RAS 与肺癌

3 Ras→Raf→MEK→MAPK 信号转导途径与恶性肿瘤

4 六神丸的方药分析

5 六神丸治疗实体瘤的研究进展

6 六神丸抗肿瘤的药理研究

7 结果分析

7.1 实验研究

7.2 临床研究

结语

参考文献

综述

参考文献

附录

致谢