手工克隆猪体细胞核移植胚胎的研究

摘要

本研究选择胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过化学辅助手工去核的途径构建猪的核移植重构胚。尝试建立适合本实验室猪的手工核移植体系，为今后建立高效的手工克隆猪体细胞核移植研究打下基础。实验主要结果如下：
　　1.本研究利用猪耳组织块培养法接种,培养3～4d，可见细胞沿着组织块边缘向外爬出，6d左右即可明显观察到细胞沿着组织块的周围长出，呈典型成纤维状。用30％FBS+10%DMSO+60%DMEM冻存细胞，经过细胞复苏后4～6h可见细胞贴壁，细胞存活率达90%以上。通过消化处理后，可以获得猪胎儿成纤维细胞。这样为以后的核移植研究提供了供核细胞。
　　2.脱羰秋水仙碱诱导猪卵母细胞显核。通过比较在不同的时间和不同的Deme浓度对猪卵母细胞显核的影响。结果显示：①添加不同浓度的DC处理卵母细胞1 h，各组去核率经统计分析差异不显著，而以0.4μg/mL的浓度组显核率最高，达到80.8%，②0.4μg/mL DC诱导猪卵母细胞显核，处理30，40,50，60min时获得的显核率较高（75.5%；75.0%；74.5%；72.8%），各组去核率差异不显著。
　　3.研究了在不同电场强度、电脉冲次数和电场时程三个条件下对猪去核卵母细胞融合的影响。结果表明：①在电场时程30μs，1 DC时，电场强度0.8kv/cm的条件下卵母细胞的融合率（94.7%）较其他各组高；当场强继续增大时，融合率下降（88.6%，87.7%，84.3%）。②在电场强度为0.8kv/cm，1次直流脉冲的条件下，脉冲时程初始为30μs时，卵母细胞融合率为94.7%；当脉冲时程达到60μs和90μs时，融合率分别是86.5%和83.8%；卵母细胞的融合率有明显地下降。③在电场强度为0.8kv/cm，电场时程为30μs的条件下，1次电脉冲激活卵母细胞的融合率（94.7%）和2次电脉冲的融合率（95.6%）无显著差异（94.7%，95.6%,P﹥0.05），但两者显著高于3次电脉冲的融合率（81.7%）。
　　4.通过以传统和手工两种方法对猪卵母细胞进行核移植研究。结果显示：手工去核后进行核移植得到的无透明带重构胚的分裂率（53.1%）与显微挤压去核方法获得的重构胚的分裂率（55%）无显著差异。

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英文缩略词表

第一章 文献综述

1.1 哺乳动物体细胞核移植研究进展

1.2 体细胞克隆发展历程

1.3 体细胞核移植技术的应用前景

1.4 体细胞克隆关键技术

1.5 我国的体细胞克隆发展历程

1.6 猪卵母细胞体外成熟研究

1.7 体细胞克隆技术相关机理

1.8 猪体细胞克隆相关技术途径

1.9 研究目的与意义

第二章 供体细胞的制备

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 猪卵母细胞体外成熟

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 体外成熟的猪卵母细胞的消化和去核

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 手工克隆猪体细胞核移植胚胎的构建

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

第六章 结论与展望

6.1 本研究的主要结论

6.2 创新点

6.3 工作展望

参考文献

致谢

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