反义表达LeHsp110/ClpB对番茄耐热性的影响

摘要

分子伴侣(molecularchaperone)是生物体内一类影响许多多肽结构和功能的蛋白，它们通过控制、结合和释放来帮助被结合多肽在体内进行折叠、组装、转运或降解等。在胁迫条件下，分子伴侣起稳定蛋白质结构的作用，防止蛋白质凝聚、变性，并具有修复变性蛋白的能力。ClpB具有分子伴侣功能，是Clp蛋白家族的一员。与Clp蛋白家族其他成员不同的是ClpB具有较长的中间区域；ClpA和ClpX具有ATP酶活性，可以调节ClpP介导的蛋白水解活性，C1pB不能调节ClpP介导的蛋白水解活性，但具有分子伴侣活性，能瓦解蛋白聚集体，并协同其它的分子伴侣修复变性蛋白。本实验室从番茄cDNA文库中克隆到定位于叶绿体的ClpB，分子量为110kD，命名为LeHsp110/ClpB。已有的研究结果表明，LeHSP110/ClpB在常温下不表达，受高温诱导，是典型的热诱导型基因。为了研究LeHSP110/ClpB与植物耐热性的关系，本论文利用反义技术，抑制LeHsp110/ClpB在番茄中的表达，结果表明LeHSP110/ClpB在番茄耐热性中具有重要作用。本论文主要结果如下： 1、LeHSP110/ClpB的亚细胞定位利用TargetP和ChloroP软件对LeHSP110/ClpB的氨基酸序列进行了在线分析，发现预测的蛋白前体含有叶绿体定位信号肽(76个氨基酸)。根据预测结果，选取LeHsp110/ClpBcDNA5'端345bp的DNA片段与绿色荧光蛋白基因(gfp)融合构建嵌合载体，利用农杆菌介导的叶圆盘法转化烟草。选取PCR检测为阳性的转基因烟草，撕取叶片表皮进行激光扫描共聚焦显微镜观察，发现GFP在叶绿体部位表达，证明该蛋白确实定位于叶绿体中。 2、转反义LeHsp110/ClpB番茄的获得选取LeHsp110/ClpBcDNA5'端330bp的DNA片段(该片段包括LeHsp110/ClpB的5'UTR区，叶绿体信号肽编码区和部Hsp100/ClpB基因在进化上的高变异区)构建反义表达载体，利用农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄，共得到17个独立转化系。Northern杂交结果表明，高温下反义转基因番茄中内源内源LeHsp110/ClpB基因的表达被明显抑制；Western分析结果表明LeHSP110/ClpB蛋白表达水平也显著下降。 3、转反义LeHsp110/ClpB番茄的耐热性分析将转基因番茄T3代抗性苗于38℃预处理2小时后转移至更高温度进行热激处理，然后于正常生长条件下进行恢复。在恢复过程中，转基因番茄逐渐枯萎死亡，而未转基因番茄与转载体对照番茄仍能存活，表明转反义基因番茄的高温耐受性降低。 叶绿素荧光指标的测定结果表明，高温胁迫下，转基因番茄的Fv/Fm(反映PSⅡ最大光能转化效率)比对照番茄显著下降，而同时F0上升更明显，说明转基因番茄的光系统Ⅱ比对照番茄更易受到伤害。叶绿素含量的测定结果表明，高温胁迫后转基因番茄植株与对照植株叶绿素含量均呈现下降趋势，但是转基因植株下降速率要大于对照植株。其可能原因是经过预处理(38℃，2h)对照番茄植株中HSP¨0/C1pB的表达提高了对致死高温的更高抗性，而转基因植株耐热性丧失，说明LeHSP110/ClpB与植物的耐热性相关。

目录

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摘要

第一章文献综述

第二章材料与方法

第三章结果与分析

第四章讨论

参考文献

附录

致谢

硕士学位期间整理发表的论文