棉花T-DNA标签雄性不育突变体的鉴定与相关基因的克隆及分析

摘要

目前，拟南芥、水稻、玉米等植物的基因组测序已经完成，将这庞大的遗传信息与基因功能联系起来为主要目标的功能基因组学已成为生物科学研究的重点。在植物的基因克隆和功能分析研究中有许多种策略，利用突变体就是其中之一。但是自然条件下突变体发生的频率非常低，且不容易被发现，所以主要用各种物理、，化学和生物技术的方法来人工诱导产生突变体。农杆菌介导的T-DNA标签法是目前是研究植物功能基因组最有效、使用最广泛的手段。国际上通过拟南芥重要性状突变体研究双子叶植物的生理、发育问题，取得了显著的成就，解决了许多以前无法解决的一些重大科学难题。拟南芥中通过T-DNA法克隆的基因占到其所有克隆基因的40％。对这些基因功能的研究和利用将为提高作物的产量、品质、抗逆提供更有效的途径。 棉花是世界上重要的经济作物，提高皮棉产量和改良纤维品质具有重要的经济效益。目前，利用不同品种间的杂交优势，即杂种优势利用，是提高产量和改良纤维品质的主要手段之一。但是目前生产上大面积推广的杂交组合，仍然以人工去雄授粉为主，制种成本过高已经成为棉花杂种优势利用的主要限制因素。棉花已经鉴定了一些不同类型的雄性不育系，但一直难以在杂交制种中应用。因此利用基因工程手段克隆育性相关的基因，并加以利用创造理想的棉花雄性不育系类型，可能成为促进杂种优势利用，提高棉花产量和品质的新途径。 本文研究利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入得到的具有突变表型的TO代转基因棉花突变体，与野生型Coker3 12杂交后得到了产生育性分离F1代，Southem杂交分析和PCR分析证明雄性不育突变表型是由单位点单拷贝的T-DNA插入引起的显性突变。为了研究该T-DNA插入点的基因组序列的功能和对棉花生殖发育的影响机制，对雄配子体减数分裂的过程进行了研究并对花药做石蜡切片分析突变产生的时期和位置。发现花粉母细胞到四分体小孢子时期突变体发育正常，但小孢子从胼胝质释放出来后，突变体的许多四分体并不分开。利用TAIL-PCR、inverse PCR、筛选基因组文库等方法克隆插入位点的基因组序列，共得到了2240bp的基因组序列。对比T-DNA插入前后的序列变化和对插入位点基因组序列进行生物信息学分析，发现T-DNA的插入导致了11 5bp的缺失和right border一侧的部分序列的重排。对克隆的2240bp的T-DNA插入位点的棉花基因组原始序列进行BLAST分析，结果显示一段与拟南芥一snoRNA基因同源性为71％的125bp的核苷酸序列，位于T-DNA插入的右边界一侧；一段与陆地棉mRNA同源性为94％的444bp的序列，位于T-DNA插入的左边界一侧；该序列的功能还有待下一步的验证。

目录

声明

第一部分文献综述

一根癌农杆菌的研究简史

1根癌农杆菌的Ti质粒的结构

2 T-DNA转移的机制

二基因克隆和功能的研究

1以人工突变体为基础的基因克隆方法

2基因功能研究的主要方法

3以PCR为基础的克隆已知序列侧翼序列的研究方法

三棉花雄性不育系研究、利用现状与存在问题

1雄性不育的类型

2棉花雄性不育机理的研究

3杂交中雄性不育的利用

四本研究的目的和意义

第二部分实验论文

一材料和方法

1实验材料

2实验方法

二实验结果及分析

1突变体的鉴定与遗传分析：

2 Southern杂交结果与分析：

3雄配子在花药中的形成制片及分析

4花药切片结果及分析：

5 TAIL-PCR扩增T-DNA flanking sequence结果及分析

6 F1代突变体显性突变的验证

7测序结果及分析

三讨论

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

致谢