卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究及中华补血草LsNHXs基因的功能研究

摘要

第一章卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究 甲基溴是在全球被广泛采用的一种熏蒸杀虫剂，但是，甲基溴对臭氧层和环境有破坏作用。国际组织呼吁尽快淘汰甲基溴，因此，甲基溴替代技术的开发迫在眉睫。 卤代甲烷的生物合成由以下酶促反应完成：SAM（S—腺苷甲硫氨酸）+X—（Cl—，Br—，r）→CH3X+S—adenosylhomocysteine（S—腺苷高半胱氨酸），反应由一种甲基转移酶（methyl chloride transferase MCT）催化完成。本实验克隆了来源于甜土植物—拟南芥及来源于盐生植物—盐芥和盐地碱蓬的MCT基因AtMCT（AtHOL）、ThMCT和SsMCT。通过基因工程手段将这三个基因转入烟草，实现基因的过量表达。 土壤甲基溴熏蒸的目标在于杀死具有较高耐药性的病源物的孢子或其他休眠形式，熏蒸所需浓度高，这也是造成环境污染的原因。通过转基因手段，赋予转基因烟草微量、持续产生甲基溴的能力，病源物侵染时可直接对其作用，从而替代甲基溴土壤熏蒸。此技术在国内外尚属首创。 主要实验结果如下： 1）利用RT—PCR和RACE方法克隆获得ThMCT和SsMCT基因的全长序列。ThMCT基因全长923 bp，开放阅读框为681 bp，共编码226个氨基酸，蛋白分子量约为25.1 KD。SsMCT基因全长1094 bp，开放阅读框为699 bp，共编码232个氨基酸，蛋白分子量约为25.8 KD。 2）将AtMCT、 ThMCT和SsMCT的全长ORF构建到植物双元表达载体pINT4中，用农杆菌介导的叶圆盘法转化烟草，分别获得了18个AtMCT．20个ThMCT和38个SsMCT基因独立的转化株系。 3）对转基因植株进行分子鉴定。PCR分析、Southern和Northern杂交结果表明外源基因已整合进烟草的基因组中并正常转录。用总蛋白作Western杂交，三种转基因植株均有杂交信号。但是如果主要用可溶性蛋白作Western杂交，则只有AtMCT转基因植株有杂交信号，而ThMCT和SsMCT转基因植株均没有杂交信号。 4）用不同浓度的处理液处理野生型和转基因烟草，用气/质联用仪测定其CH3Cl、CH3Br和CH3I的释放量。AtMCT转基因植株a12三种气体的释放量明显高于野生型对照，是对照的100倍左右，而ThMCT和SsMCT转基因植株的释放量和对照差异不明显。 5）对AtMCT转基因植株a12和野生型植株接种线虫，在施加Br—，增加底物的情况下，AtMCT转基因植株提高了对线虫的抗性。 第二章中华补血草LsNHXs基因的功能研究 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐逆密切相关，它利用液泡膜H+—ATPase及H+—PPase泵H+产生的驱动力把Na+区隔化入液泡中以消除Na+的毒害，除此之外，液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白还与PH调节、囊泡运输、液泡的发育以及蛋白质分选有关。液泡不仅是一个物质储存细胞器，在特定的生理条件下，某些植物细胞的液泡可参与矿质离子、简单糖类、有机酸和氨基酸等物质的运输。 早期的电镜观察发现，补血草盐腺分泌细胞内有大量的线粒体和丰富的内质网，缺少清晰的中央大液泡，但细胞内有许多液泡样的小囊泡，小囊泡大部分都靠近细胞质膜且经常出现与质膜的融合，推测囊泡运输参与了补血草的泌盐过程。由此推测补血草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白LsNHXs将对补血草的泌盐产生一定的影响。因此，本实验克隆了LsNHXs基因，并利用RNAi技术对其功能进行了研究。 主要实验结果如下： 1）采用RT—PCR和3’—RACE方法从补血草中克隆获得LsNHXs基因家族三个成员LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的保守区序列以及LsNHX2和LsNHX3的3’端特异序列。 2）构建植物基因RNAi沉默表达载体并转化补血草，获得三个单基因和一个双基因的RNAi沉默表达植株，快繁转基因植株供分子鉴定和耐逆分析。 3） LsNHX1转基因植株叶片表面分泌物中的Na+、K+离子含量比野生型对照显著增加；叶组织内Na+离子含量和K+离子含量均略高，但差异不显著；K+/Na+比没有显著差异。 4） LsNHK2转基因植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比野生型对照有所下降，但差异不显著；K+离子含量比对照显著降低。LsNHX2转基因植株叶组织内Na+离子含量略高，但差异不显著；K+离子含量和K+/Na+比均降低。 5） LsNHX3转基因植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比对照增加，但差异不显著，K+离子含量比对照增加，在400 mM NaCl条件下达到显著差异；叶组织内Na+离子含量和K+离子含量均略高；K+/Na+比没有显著差异。 6）LsNHX1+LsNHX2双基因沉默植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比野生型对照增加，K+离子含量与野生型对照相比没有显著差异。转基因植株叶中Na+离子含量略高，但差异不显著；转基因植株叶中K+离子含量及K+/Na+比均降低。 以上结果表明，LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的作用机制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上，沉默表达后，区隔化的Na+离子含量降低，导致通过囊泡运输分泌的Na+离子含量降低。LsNHX1和LsNHX3可能定位于中央大液泡上，主要负责Na+的区隔化；沉默表达后，液泡中区隔化的Na+离子含量降低，胞质中的Na+离子含量增加，刺激盐腺泌盐，导致叶片分泌的Na+离子含量增加。 本研究的主要创新点： 1.首次克隆了盐生植物—盐芥、盐地碱蓬的卤代甲烷甲基转移酶基因ThMCT和SsMCT，并对其序列特征进行了详细的分析。 2.通过过量表达卤代甲烷甲基转移酶基因，提高转基因烟草释放甲基溴的能力，使转基因烟草微量、持续产生甲基溴，从而替代甲基溴土壤熏蒸。此技术在国内外尚属首创。 3.首次克隆了补血草的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白LsNHXs基因家族三个成员LsNHK1、LsNHX2和LsNHX3的部分序列，并将这三个基因分别作了RNAi沉默表达。研究发现LsNHX1、LsNHX2、LsNHX3的作用机制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上，通过囊泡运输对补血草的泌盐起一定的作用，而LsNHX1和LsNHX3可能定位于中央大液泡上，主要负责Na+的区隔化。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略表

声明

第一部分 文献综述

一、卤代甲烷酶促合成机制

1卤代甲烷的生物产生机制

2卤代甲烷甲基转移酶基因的克隆

3卤代甲烷酶促反应机制的生物学意义

4卤代甲烷的植物发生论

二、Na+/H+逆向转运蛋白

1 Na+/H+逆向转运蛋白的分子特性及转运机制

2植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白

3 NHE/NHXNa+/H+逆向转运蛋白与囊泡运输

4植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白

三、囊泡介导的植物细胞可溶性物质的转运

1囊泡参与盐的分泌

2囊泡参与蜜的分泌

3囊泡参与有机酸和蔗糖的分泌

4囊泡参与保卫细胞和运动细胞的溶质运输

5囊泡参与糖和黏附多糖的分泌

四、本实验的意义

1甲基溴替代技术的开发

2中华补血草泌盐机制探讨

第二部分 实验论文

第一章　　卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二章 中华补血草LsNHXs基因的功能研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

图版

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文

致谢