梓树中抗菌化合物的分离纯化及其抗菌性的研究

摘要

植物是生物活性化合物的天然宝库，抗菌活性物质在植物中广泛存在。近年来，国内外对于植物抗菌成分的提取、筛选、抗菌性能和抗菌机理进行了大量试验研究，并取得了较大的进展，许多抗菌活性物质从植物体内分离、鉴定出来。这些具有抗菌活性的植物有效成分类型较多，主要有皂甙类、有机酸、挥发油类、黄酮类、萜类、甾类、生物碱类、醌类等。 梓树是紫葳科梓属植物，树皮习称梓白皮，果实称梓实，均供药用，具有清热、解毒、杀虫和利尿的功能。国内外对其在医药临床方面的研究报告很多，而对其在抗菌作用及抗菌成分方面的报道却很少，本文以梓树果实为实验材料对其抗菌活性进行了系统研究，首次发现了梓树果实的抗菌作用，探索出适合梓树果实粗提液中抗菌活性物质分离纯化以及大量制备的简单途径，并且首次在梓树果实中分离出抗菌活性成分对羟基苯甲酸。 首先将梓树果实的粉末用乙醇浸提，提取液蒸至膏状后用甲醇重溶，得到梓树果实粗提液。以枯草芽孢杆菌为供试菌，采用管碟法研究了粗提液的抗菌活性和稳定性，并测定了粗提液对于其它六种供试菌：密执安棒杆菌番茄溃疡病致病型病菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、雷尔氏菌（青枯病菌）和欧氏杆菌胡萝卜软腐亚种（胡萝卜软腐病菌）的抑制作用。实验表明梓实粗提物对枯草芽孢杆菌具有比较好的抑制作用，而且相对浓度和抑菌圈面积呈现了很好的梯度变化。粗提物具有较好的稳定性和广谱的抗菌性，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的生长均表现出良好的抑制作用，加热处理、低温保存、反复冻融对其活性没有影响，均能够显著的抑制枯草芽孢杆菌的生长。 采用凝胶过滤层析SephadexLH-20和RP-HPLC制备并结合抑菌活性追踪的方法，分离纯化梓实中能够抑制多种病原菌的主要活性成分。实验发现粗提物经过两次SephadexLH-20分离后，31～36管中的组分具有对枯草芽孢杆菌的抑制作用，合并有活性的部分，重复收集若干次。在分析型高效液相色谱仪上对样品进行分离条件摸索时，在甲醇的比例为30％的洗脱强度下，待分离物质基本达到基线分离，出现三个完全分开的峰，经检验峰二具有抗菌活性。随后在半制备型高效液相色谱仪上进行分离制备，最后得到冻干的样品，纯度为99.926％。 对样品的紫外吸收光谱、质谱、核磁共振谱进行测定，根据图谱推测出该抗菌化合物的结构为对羟基苯甲酸。通过对样品与标准品进行HPLC和质谱对比分析，验证了样品的结构。并测定了标准品对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的MIC，分别为3mg/mL、1mg/mL、1mg/mL。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 文献综述 植物中抗菌活性物质研究概况

1.1具有抗菌活性的植物资源

1.2植物中的有效抗菌成分

1.3植物抗菌化合物的提取

1.4植物抗菌化合物的分离和纯化技术

1.5结构研究的方法

1.6梓属的研究概况

1.7本文的研究目的及意义

第二章 梓树果实粗提液的制备及其抑菌活性的研究

2.1材料与方法

2.1.1植物材料

2.1.2菌株

2.1.3主要实验仪器

2.1.4主要试剂

2.1.5菌悬液浓度测定方法

2.1.6抗菌活性的测定方法

2.2试验内容

2.2.1梓树果实粗提液的制备

2.2.2菌株的保存与菌悬液的备用

2.2.3粗提物进行浓度梯度的抑菌试验

2.2.4粗提物稳定性的测定

2.2.5粗提物的抗菌谱

2.3结果与分析

2.3.1粗提物进行浓度梯度的抑菌试验

2.3.2不同温度加热处理对粗提物抑菌活性的影响

2.3.3加热时间对粗提液抑菌活性的影响

2.3.4低温保存对粗提液抑菌活性的影响

2.3.5反复冻融对粗提物稳定性的影响

2.3.6粗提物对多株细菌病原菌的抑制作用

2.4讨论

第三章 梓树果实粗提液中抗菌活性物质的分离纯化

3.1材料与方法

3.1.1植物材料

3.1.2指示菌

3.1.3主要实验仪器

3.1.4其它实验仪器

3.1.5主要试剂

3.1.6凝胶过滤层析的使用

3.2实验内容

3.2.1分子筛第一次分离

3.2.2分子筛第二次分离

3.2.3样品的反相高效液相色谱分离及制备

3.3结果与分析

3.3.1样品的第一次凝胶过滤层析

3.3.2样品的第二次凝胶过滤层析

3.3.3高效液相色谱条件摸索

3.3.4高效液相色谱分离出各峰的抗菌活性测定

3.3.5抗菌活性物质在半制备型高效液相色谱仪上的分离制备

3.4讨论

第四章梓树果实粗提液中抗菌活性物质的结构鉴定

4.1材料与方法

4.1.1紫外／可见光分光光度计（UV/VIS Spectrophotometer）

4.1.2液质联用仪(LC/ESI-MS)

4.1.3核磁共振波谱仪

4.1.4最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

4.2实验内容

4.2.1分析型高效液相色谱仪进行纯度分析

4.2.2冻干样品的吸收光谱

4.2.3液质联用分析

4.2.4核磁共振分析

4.2.5样品结构的验证

4.2.6 MIC和MBC的测定

4.3实验结果

4.3.1分析型高效液相色谱仪进行纯度分析

4.3.2冻干样品的吸收光谱

4.3.3质谱分析

4.3.4样品的核磁共振分析

4.3.5样品结构的验证

4.3.6样品MIC和MBC的测定

4.4讨论

参考文献

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致谢