高脂高胆固醇饮食喂养的apoE小鼠肝脏脂代谢相关基因的表达研究

摘要

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种多因素引起的疾病，涉及遗传、代谢和环境等诸多因素。研究表明，饮食在AS发生、发展和演变过程中起着重要作用。因此，针对饮食影响AS发生机制以及病变过程的研究，将有助于发现新的预防和治疗手段。研究显示，对易患AS的动物喂以富含饱和脂肪酸与胆固醇的的饮食可以增加心血管病的发生率。长期消耗高脂饮食可以导致AS相关的血脂代谢紊乱，这是一种代谢综合症的形式，以高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高胰岛素血症和其它的AS危险因子为特征。 肝脏是研究脂类代谢的重要靶器官。作为内源性和外源性脂代谢途径的交汇点及调节中心，肝脏能够合成、释放各种脂蛋白及脂代谢酶类，在脂类代谢平衡中发挥着重要作用。载脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）缺失(apoE-/-)小鼠对富含胆固醇的脂蛋白清除障碍，从而导致血浆总胆固醇(totalcholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和极低密度脂蛋白（very low density lipoprotem，VLDL）水平增高，并促使泡沫细胞形成，堆积于血管壁内，因此普通饮食喂养的apoE-/-小鼠在幼龄时即表现为血脂代谢紊乱以及自发性AS，并随年龄增长逐渐加重。 高脂高胆固醇饮食是导致AS发生发展的重要因素。尽管高脂高胆固醇饮食导致脂代谢紊乱的研究开展的较多，但是其分子机制尚不清楚。高脂高胆固醇饮食对这些过程及代谢综合症的形成，与相关基因的表达变化密切相关。许多转录因子能够对不同的饮食刺激产生应答，例如过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)和肝X受体α（liver X receptorα，LXRα)。到目前为止，尚不清楚这些转录因子在高脂高胆固醇饮食喂养的apoE-/-小鼠中对基因表达所起的作用，因此，本实验针对饮食与肝脏脂代谢紊乱的关系以及涉及的可能致脂代谢紊乱的作用机制等问题，采用经典的AS小鼠模型，探讨了高脂高胆固醇饮食对肝脏PPARα、LXRα及其靶基因的影响，以及它们在调控脂代谢中的作用，为饮食影响脂代谢紊乱发病机制的研究及AS治疗提供理论依据和研究平台。 方法：本实验分析了PPARα、LXRα及其靶基因在幼龄apoE-/-小鼠及相同遗传背景的同龄野生型(widetype，WT)小鼠肝脏中的表达特征及其与血脂紊乱和AS早期病变的关系，利用半定量和实时定量RT-PCR技术，检测21天龄、1、2和3月龄apoE-/-小鼠及WT小鼠肝脏脂代谢相关基因的表达，并进行血生化指标及肝脏和主动脉病理形态学检测。 通过实验得到如下结果： 1.利用半定量RT-PCR在肝脏中检测了8条脂代谢相关基因。在高脂高胆固醇饮食的作用下，LXRα、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、血管生成素样蛋白3（angiopoietin-likeprotein 3，Angpt13）在8周龄和12周龄的apoE-/-和WT小鼠中均显著上调。在apoE-/-小鼠组内，载脂蛋白AIV（apolipoprotein AIV,apoAIV）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoyl-COA desalurase-I，SCDI）、载脂蛋白B100（apolipoprotein B100，apoB100）在8和12周龄时被高脂高胆固醇饮食显著上调，肉碱棕榈酰转移酶I(carnitine palmitoyl transferase I，CPTI)和酰基辅酶A氧化酶1(acyl coenzyme A oxidase 1，ACOX1)在4和8周龄时显著下调。在WT小鼠组内，CPTI在8和12周龄时被高脂高胆固醇饮食显著上调，apoAIV、SCDI和apoB100的表达没有明显的变化。 2.利用荧光实时定量RT-PCR检测了肝脏中6条脂代谢相关基因。在apoE-/-小鼠组内，PPARα的表达量在12周龄时被高脂高胆固醇饮食显著下调，在WT小鼠组中，PPARα的表达量在12周龄时被高脂高胆固醇饮食显著上调。高脂高胆固醇饮食显著下调了apoE-/-小鼠载脂蛋白AI（apolipoproteinA I，apoAI），B类清道夫受体I(scavenger receptor class B type I，SR-BI)和载脂蛋白AV（apolipoprotein AV,apoAV）的表达。而在WT小鼠中，apoAI和apoAV的表达量没有明显的变化，SR-BI的表达显著上调。脂蛋白脂酶(lipoprteinlipase，LPL)和脂肪酸转运体（fatty acid translocase，FAT/CD36）在两种基因型的小鼠中均被高脂高胆固醇饮食显著上调。 3.在apoE-/-小鼠组内，TC、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平在4周龄时，被高脂高胆固醇饮食显著上调，并且这种趋势一直持续到3月龄。甘油三酯(triglyceride，TG)水平在8周和12周龄时有显著的提高。在WT小鼠组中，TC、LDL-C和HDL-C的水平在8周龄和12周龄时被高脂高胆固醇饮食显著上调，但TG的水平并没有发生变化。 4.ApoE-/-小鼠喂以高脂高胆固醇饮食后，8周龄的小鼠形成了明显的肝脏脂肪变性，且病变程度在12周龄时更加严重。普通饮食的apoE-/-小鼠在12周龄时可见有明显的脂质沉积，但与同年龄的高脂高胆固醇饮食组相比，脂质沉积明显减少。WT小鼠组内，只在高脂高胆固醇喂养的12周龄小鼠肝细胞中发现少量脂滴。 5.利用光学显微镜观察发现，在apoE-/-小鼠，高脂高胆固醇饮食加重了动脉粥样斑块的发展，在相应的年龄阶段导致了更加严重的脂质沉积。于12周龄时，高脂高胆固醇饮食组的apoE-/-小鼠的病变面积是普通饮食组的两倍。而在WT小鼠组中，高脂高胆固醇饮食在各年龄段均未引起明显的脂质沉积。 以上实验结果显示，在高脂高胆固醇饮食的作用下，脂代谢相关基因在幼龄的apoE-/-小鼠中即发生表达水平的变化，与肝脏脂肪变性以及主动脉AS病变发生发展过程呈现正相关，说明其可能在幼龄小鼠脂质代谢紊乱发生过程中起着重要作用，从而进一步影响了动脉内皮细胞功能改变乃至AS早期病变的发生。但是在WT小鼠中，高脂高胆固醇饮食却没有引起这些变化，提示饮食对不同遗传背景的小鼠具有不同的调控机制。上述相关因自的蛋白水平及其活性分析，将有助于进一步深入了解这些靶基因/蛋白的变化特征与AS发生发展的关系。目前相关工作正在进行之中。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

声明

第一部分综述

1.AS研究概况

2.ApoE 与AS

3.脂代谢与AS

4.研究展望及本课题开展意义

第二部分实验

第一章ApoE基因缺失小鼠模型的基因型鉴定

1.1实验材料与方法

1.2结果

1.3结论

第二章生化检测

2.1材料与方法

2.2结果

2.3结论

第三章肝脏病理形态学观察

3.1材料与方法

3.2结果

3.3结论

第四章主动脉根部病理形态学观察

4.1材料与方法

4.2结果

4.3结论

第五章 脂代谢相关基因在ApoE-/-及WT小鼠肝脏中的表达分析

5.1 RT-PCR分析

5.2荧光实时定量RT-PCR分析

5.3结果

5.4分析与讨论

结论与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文