基于微流控芯片细胞中非稳态物质超氧自由基的分析检测

摘要

细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元。在生物体的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基，如：超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(HO·)、脂自由基(ROO·)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)、过氧亚硝基阴离子(ONOO-)等。研究表明，生物体内活性氧自由基水平直接与生物的生理、病理相关。适当水平的活性氧对维持生物正常的生理过程是重要的；过量自由基的产生并累积则会诱导生物体产生老化及各种疾病。O2-作为其他活性氧的前导物，过量时不仅会对生物体内的许多生物分子造成损伤，而且还能通过其它途径转化成毒性更大的HO·、H2O2、1O2等自由基。目前检测超氧阴离子自由基的方法主要有电子自旋共振法(ESR)、高效液相色谱法(HPLC)、化学发光法(CL)、荧光法以及电化学方法等。上述方法对生物学中O2-的研究起到了很好的帮助作用。然而，由于细胞尺度小、胞内超氧自由基的半衰期非常短、稳态浓度极低，以及缺少对O2-有效捕获的探针等因素的制约，使得目前具备高选择性，高灵敏度和生物实用性的O2-分析检测方法还是比较少的。一些传统的分析方法多是将各种活性氧自由基作为一个整体，获得的结果多是基于静态、宏观的观察和整体平均而推导出来的。存在取样体积大、质量检测限高、分析时间长、仪器价格昂贵等不足。为此，发展高选择性、高灵敏度的识别与快速、定量测定超氧阴离子的分析方法对当今自由基生物学研究十分必要。 自20世纪90年代初Manz和Widmer等首次提出以多学科交叉为特征的微全分析系统(miniaturized total analysis systems，μ-TAS)的概念以来，微流控芯片(microfluidic chip)已成为近年来分析化学、生物化学、医学等领域微分析系统研究的重要技术平台之一。微流控芯片电泳(microfluidic chip based CE，MCE)是在具有微通道网络结构的芯片上，通过微流体驱动/控制、检测等技术单元的组合，实现生化样品的进样、分离与检测等功能，具有快速、低耗、高效及多种功能集成等优点。微流控芯片电泳用于细胞组分分析已成为近年来各学科交叉研究的热点。本论文从分子水平上分离、分析检测O2-出发，以自行搭建的微流控芯片电泳--激光诱导荧光检测系统为技术依托，以实验室设计合成的荧光探针为基础，对细胞中O2-的检测方法进行了研究。与传统的O2-分析检测方法相比，该检测方法得到的浓度更逼近了细胞内O2-的真实水平，力图为具有潜在生物医学应用价值的微流控自由基分析检测奠定基础。本论文共分三章，概述如下： 第一章，微流控芯片用于细胞组分分析研究的概述。 第二章，选用实验室合成的2-氯1，3-二苯并噻唑林环己烷(DBZTC)为荧光标记试剂，以微芯片电泳-激光诱导荧光检测(MCE-LIFD)为分析技术平台，建立了一种快速检测肝癌细胞匀浆中O2-的方法。最佳的电泳条件下，30s内实现了超氧自由基的检测，得到的线性范围为4.0×10-7-1.0×10-5M；浓度检测限(S/N=3)为0.15μM，质量检测限为0.03fmol(样品进样体积为200pL)；峰面积和迁移时间的相对标准偏差(RSDs)分别为2.6％和3.8％。干扰试验表明，该方法在生物体系中，1000倍过量H2O2不干扰检测。最后将该方法应用到肝癌细胞和PMA刺激的小鼠巨噬细胞中O2-的检测，回收率分别为97.3％和98.6％。 第三章，基于第二章已建立的分析体系，进行了微流控芯片上单个肝癌细胞中O2-的分析检测方法的研究。在完成肝癌细胞培养、确定芯片结构的基础上，针对细胞的强吸附、无规律群聚以及芯片内外需要等渗压的特点，探索了细胞表面预处理以及微流控芯片上操纵单细胞的方法。确定了电动操纵单细胞的最佳电压条件。初步实现了单个肝癌细胞的进样、分离。单细胞溶膜及胞内O2-的检测有待进一步实验优化。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1引言

2微流控芯片用于细胞组分分析检测概况

3本论文研究内容

参考文献

第二章微芯片电泳激光诱导荧光法快速检测肝癌细胞匀浆中超氧自由基

1.前言

2实验部分

3结果与讨论

4结论

Reference

本章英文译稿

第三章微流控芯片单个肝癌细胞中超氧自由基的分析检测

1前言

2实验部分

3结果与讨论

4总结与建议

参考文献

作者发表的学术论文及参加的课题

致谢