沿海地区盐地碱蓬的分子标记研究

摘要

藜科碱蓬属(Suaeda)一年生草本植物盐地碱蓬(Suaeda salsa)是典型的真盐盐生植物，具有很强的抗逆能力，它对海滨盐渍土壤具有明显的修复作用，盐地碱蓬在工业、医药、生态等方面具有重要的利用价值。有关盐地碱蓬的抗性生理、分子及基因工程、生态功能、利用开发等诸多方面已经有了一定的研究，然而针对盐地碱蓬的植物遗传学和分类学研究却比较有限，针对这个现状，本研究运用RAPD和ISSR分子标记技术对沿海地区4个省市的8个自然居群的盐地碱蓬进行了遗传多样性和遗传结构、分化的研究，同时讨论了地理距离和盐地碱蓬自然居群间遗传多样性和遗传结构的关系。本研究主要获得了以下结果:
　　1.改进了针对不同地区盐地碱蓬的RAPD反应体系和程序。RAPD反应体系为20μL:含30～50ng DNA，1.0μmol/L引物，2.5μl10×PCR Buffer(100mmol/LTris-HCl PH8.4，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，1 mg/ml BSA)，0.2mmol/LdNTPs，1U Taq酶；RAPD-PCR反应程序为:使用94℃预变性5min；接46个循环，每个循环94℃，1min；36℃，1min；72℃，1.5min；再接72℃延伸10min，扩增完后置于4℃保存。ISSR-PCR反应体系为20μL含约50ng DNA，0.5μmol/ L引物，10×PCR Buffer，2.5mmol/ L MgCl2，0.2 mmol/ L dNTPs，1.5U Taq酶。ISSR-PCR反应程序为:94℃预变性5 min；接着进行35个循环:94℃变性50s，50℃-55℃退火45s，72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸5min；扩增完后置于4℃保存。
　　2.应用RAPD、ISSR两种分子标记方法揭示了沿海地区盐地碱蓬物种的遗传多样性水平:在本研究的RAPD和ISSR分析中，运用3个指标来评价盐地碱蓬的遗传多样性:多态性位点所占比例(P)、平均期望杂合度(H)、Shannon's多样性指数(I)。在RAPD分析中三者的平均值分别是63％、0.1933、0.2915；在ISSR分析中三者的平均值是59％、0.1718、0.2540.两种方法得到的值相近，均反应出在8个盐地碱蓬自然居群间存在中高水平的遗传多样性。
　　3.运用AMOVA分析表明了不同居群盐地碱蓬的遗传结构和变异:在本研究中RAPD分析平均 Fst值是0.3985，ISSR分析的平均 Fst值是0.5436，表明中高水平的遗传变异出现在居群间(39.85％或54.36％)。Fst值大于0.1500时表明了较高水平的遗传结构，Fst值说明居群间高水平的遗传差异和低水平的基因流动。说明在8个盐地碱蓬自然居群间，基因流动少，居群间存在高水平的遗传变异。在本研究中，认为4个省市的8个居群间有较远的地理位置，限制了不同居群间的花粉和种子散播，因而基因流动由于地理区域障碍而较少，形成了高水平的遗传结构和变异。
　　4.本研究运用Mantel测试揭示了地理位置差异与盐地碱蓬遗传多样性的关系:RAPD分析的遗传距离(D)矩阵和地理位置矩阵相比，相关性值是(r=0.617)，表明较高水平的相关；ISSR分析的遗传距离(D)矩阵和地理位置矩阵相比，相关性值是(r=0.460)，表明中水平的相关。以上结果表明不同居群的盐地碱蓬的地理位置的差异与遗传差异存在相关性，相距较远的居群间遗传差异较大，距离近的居群遗传差异小。这个结论与遗传结构研究结果相一致，地理位置产生了低水平的基因流动和高水平的遗传结构和遗传变异。

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第一章 综述

1.1 前言

1.2 盐地碱蓬的研究现状

1.3 遗传多样性研究及方法

1.4 研究的目的意义

第二章 不同盐地碱蓬自然居群的 RAPD 研究

2.1 材料与方法

2.2 RAPD-PCR 反应

2.3 RAPD 实验结果与分析

第三章 盐地碱蓬居群的 ISSR 研究

3.1 材料与方法

3.2 ISSR-PCR 反应

3.3 ISSR 结果与分析

第四章 分析与讨论

4.1 盐地碱蓬基因组 DNA 提取问题

4.2 盐地碱蓬 RAPD-PCR、ISSR-PCR 扩增的摸索与条件优化

4.3 PCR 扩增条带的统计与处理

4.4 不同自然居群的盐地碱蓬的遗传多样性水平和遗传结构

4.5 地理位置差异与盐地碱蓬遗传多样性的关系

4.6 RAPD 与 ISSR 分析不同居群盐地碱蓬遗传多样性的可信性

参考文献

附录

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