用于检测细胞内活性氧自由基的荧光探针的设计、合成及生物应用

摘要

在生物体新陈代谢过程中产生多种自由基，它们对维持生物体正常生理功能发挥重要作用，同时自由基含量的变化与机体衰老和疾病发生又有着紧密联系，当其含量激增时可破坏体内代谢平衡，导致生理功能紊乱。臭氧(O3)是活性氧自由基(ROS)的一种，平流层中的臭氧阻止了大量的太阳紫外线，对流层中的臭氧则在危害着生物圈的安全。臭氧作为对体内炎症和外界刺激的响应还可以内源性产生，通过诱导细胞质膜的改变、破坏离子通道、改变酶的活性等诱导细胞功能紊乱，导致多种疾病如皮肤癌、呼吸道疾病等。目前用于检测O3的方法较少，包括化学发光法(CL)、电化学方法(EL)、荧光法等，由于检测灵敏度低、选择性差和反应时间长等使得对臭氧的研究远远不如其他活性氧。臭氧在细胞内的生理功能、参与的信号转导途径、与疾病的关系等仍不明确，因此发展适合生物体系臭氧检测的方法具有重要研究意义。
　　荧光探针与活细胞内自由基作用时可发生荧光强度或吸收波长位置变化，借助于激光共聚焦成像技术，可以实现细胞内活性小分子的“可视化”检测，从而对它们在生物体内的动态变化进行实时监控。
　　以近红外荧光团花菁(Cy)为母体，以L-色氨酸(L-Trp)为识别基团，设计合成了一种近红外O3检测荧光探针(Trp-Cy)。
　　在化学体系中对探针与O3的反应条件进行优化。Trp-Cy对H2O2(120μM)、NaClO(24μM)、·OH、t-BuOOH(30μM)、GSH和VC(300μM)的响应很低，对O3的检测无干扰；Trp-Cy能与O3迅速反应，荧光强度明显增强并达到最大值且保持相对稳定；探针荧光强度随着加入O3浓度的增加明显增强。O3浓度为1.0×10-6~7.0×10-6 M，表明Trp-Cy能检测臭氧浓度的微弱变化。
　　通过MTT试验研究探针对细胞体系的影响，当细胞50％存活时探针浓度为465μM，表明 Trp-Cy对细胞是低毒性的。采用激光共聚焦显微成像技术，实现了肺癌细胞 A549内O3的实时检测。
　　综上所述，探针Trp-Cy具有以下特点:⑴激发和发射位于近红外区(分别为630 nm、770 nm)，有效地避免了细胞内自身荧光的干扰，减少了对细胞的损伤；⑵具有较大的斯托克斯位移(达140 nm)，有效地避免了探针的自猝灭，提高了检测灵敏度及准确性；⑶能与O3迅速反应，不受共存的其他活性分子或金属离子的干扰，有利于实时检测细胞内O3的微小变化；⑷探针自身荧光较弱，与O3结合后荧光显著增强；⑸能特异性靶向线粒体。
　　该探针灵敏度高、反应迅速、毒性低的特点在O3对生物体系影响的研究中具有重要意义。

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第一章 绪论

1自由基的生理病理意义及检测技术

2臭氧的生理病理意义及检测技术

3.本论文的研究意义与技术路线

参考文献

第二章 基于L-色氨酸构建的一种近红外的荧光探针用于臭氧的检测和细胞成像

1 引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4结论

参考文献

全文总结与创新点

附合成产物谱图

攻读硕士学位期间参与的课题和发表的论著

致谢