二苯乙烯苷对小鼠巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响

摘要

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种缓慢而复杂的进行性病变过程.针对AS早期发病机制的研究,对于AS预防与治疗具有十分重要的意义.巨噬泡沫细胞的形成是AS早期病变的主要事件之一,其形成与巨噬细胞(macrophages，MΦ)内胆固醇的积累和代谢关系密切.摄入胆固醇过多或胆固醇外流过少,均可引起细胞内过量脂质堆积而使巨噬细胞转变为泡沫细胞.在泡沫细胞形成过程中,胆固醇外流受阻是重要环节.因此,促进细胞内胆固醇外流可预防和逆转泡沫细胞的形成,相关研究是近年来动脉粥样硬化病变防治的焦点之一.
　　研究表明,胆固醇外流目前主要有以下四种途径:(1)介导胆固醇主要外流至高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)颗粒的水溶性扩散途径;(2)B类清道夫受体I(scavenger receptor class B type，SR-BI)介导的胆固醇外流途径;(3)三磷酸腺苷结合盒转运子G1(ATP binding cassette G1，ABCG1)介导的胆固醇外流途径和(4)三磷酸腺苷结合盒A1(ATP binding cassette A1，ABCA1)介导的胆固醇外流途径.此外,研究表明内源性载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)也可介导MΦ的胆固醇外流.在上述众多胆固醇外流途径中,ABCG1和ABCA1介导细胞内大部分的胆固醇外流,有研究表明，ABCG1和ABCA1能协同且连续介导MΦ内60-70％胆固醇的外流.
　　早期流行病学研究发现,法国人有高脂饮食的习惯,但其冠心病的发病率却很低，Siemann等人发现,这主要得益于红酒中的白藜芦醇(resveratrol，RES).研究表明,RES主要通过抗脂蛋白的氧化、抗炎反应、调节脂质代谢等多种机制起保护心血管和防治AS的作用.在调节脂质代谢方面,RES在降低血清总胆固醇(total cholesterol，TC)和总甘油三酯水平的同时,对HDL水平未表现出降低作用.体外进一步研究发现,RES可促进小鼠腹腔巨噬泡沫细胞内的胆固醇向载脂蛋白AI(apolipoprotein AI，apoAI)的外流作用,该作用可能通过LXRa-ABCA1/ABCG1-apoAI信号通路实现.
　　二苯乙烯苷(tetrahdroxstilnene glucoside，TSG)是RES的结构类似物,都属于二苯乙烯类.近来研究发现,TSG能够抑制大鼠AS的斑块发展,除与其抗炎、抗氧化作用有关外,还与其能够改善脂质代谢相关,主要表现在升高血清HDL胆固醇水平、降低TC和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平.上述研究结果显示,TSG影响了血清HDL的代谢,而后者在介导 MΦ胆固醇的外流中发挥重要作用.这提示我们,TSG对AS的抑制作用可能与影响MΦ胆固醇的外流相关,目前国内外尚未见研究报道.因此,本实验研究采用RAW264.7泡沫细胞模型,研究TSG对胆固醇外流的影响,并探讨其可能机制.
　　实验结果显示:
　　1. MTT法检测不同浓度TSG(0、25、50、100和200μM)对RAW264.7细胞的影响,结果显示五种浓度对RAW264.7细胞的增殖均未产生显著影响,表明上述各浓度的二苯乙烯苷对RAW264.7细胞无明显毒性作用.
　　2.高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)测定不同浓度TSG作用下,RAW264.7泡沫细胞内TC及胆固醇酯(cholesterol ester，CE)含量的变化情况,结果显示TSG可显著降低细胞内TC和CE的含量及CE/TC的比例,100μM TSG降低作用最明显.
　　3. TSG可显著提高PPARγ、LXRα、ABCA1和ABCG1 mRNA的表达,其中以100μM影响最显著.
　　4.免疫细胞化学结果显示,100μM TSG可显著增强RAW264.7泡沫细胞ABCA1蛋白的表达.
　　5.当用TSG和PPARγ抑制剂GW9662分别处理或者共同处理RAW264.7泡沫细胞时,结果显示,TSG可通过增强LXRα、ABCA1和ABCG1的表达,减弱PPARγ抑制剂GW9662对PPARγ-LXRα-ABCA1/ABCG1信号通路的抑制作用.
　　综上所述,TSG能够通过增强ABCA1和ABCG1的表达促进RAW264.7泡沫细胞胆固醇的外流,且该作用可能是通过PPARγ-LXRα-ABCA1/ABCG1信号通路实现的.

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第一章文献综述部分

1. 1动脉粥样硬化

1.2 胆固醇与MΦ泡沫化

1.3二苯乙烯苷与胆固醇外流

1.4 本论文研究的目的、内容与意义

第二章 MΦ系RAW264.7细胞的培养

2.1实验材料与试剂配制

2.2实验仪器与耗材

2.3实验方法

2.4实验结果与讨论

第三章 不同浓度TSG对RAW264.7细胞增殖的影响

3.1实验试剂与配制

3.2实验仪器与耗材

3.3实验方法与统计学分析

3.4实验结果

3.5 讨论

第四章 MΦ系RAW264.7泡沫细胞模型的建立

4.1实验试剂与配制

4.2实验仪器与耗材

4.3实验方法与统计学分析

4.4实验结果

4.5讨论

第五章 HPLC测定TSG对巨噬泡沫细胞内胆固醇含量的影响

5.1实验试剂与配制

5.2实验仪器与耗材

5.3实验方法与统计学分析

5.4实验结果

5.5讨论

第六章 TSG对巨噬泡沫细胞胆固醇外流相关基因mRNA及蛋白表达的影响

6.1 实验试剂与配制

6.2 实验仪器与耗材

6.3实验方法与统计学分析

6.4实验结果

6.5讨论

第七章 TSG或/和PPARγ抑制剂（GW9662）对巨噬泡沫细胞胆固醇外流相关基因mRNA及蛋白表达的影响

7.1 实验试剂与配制

7.2 实验仪器与耗材

7.3实验方法与统计学分析

7.4实验结果

7.5讨论

结 论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢