Complement C6-C9基因在奶牛乳腺炎中的作用机制

摘要

奶牛遗传性状是奶牛生产中非常重要经济指标，在生产过程中生产成本及生产效率的高低直接取决于奶牛繁殖性能的高低，同时影响着奶牛产奶量和最终产奶价值。奶牛遗传力是衡量繁殖性状的一个重要标准，影响牛遗传力及繁殖力的主要因素包括：遗传、环境、营养以及疾病等。奶牛乳腺炎（Mastitis）是奶牛多发的一种常见疾病，其发病因素主要表现为由外伤、挤奶操作不当、周围环境、激素的不平衡、乳房缺陷或其他一系列疾病等诱发的病原菌入侵感染，是一种受微效多基因所调控的经病，具有复杂性、多样性以及难愈性等特点。乳腺炎发病率较高，每年造成的经济损失超过50亿元且有逐渐递增的趋势。隐性乳腺炎的诊断可通过实验室检测奶样中体细胞数（SCC）来实现，乳中体细胞数可直接反映奶牛乳房健康程度及乳品品质，且体细胞高低与产奶量的损失成正比，乳腺炎的常规防治临床上多使用注射抗生素来进行，但易造成乳中药物残留。由于牛繁殖力低且世代间隔较长，利用常规育种手段进行乳腺炎抗性育种，其目标周期过长且效率低。而当前研究的热点是通过候选基因法筛选目的基因，从基因水平，如通过查找SNP、筛选与乳腺炎抗性相关的优势等位基因和基因型，鉴定基因可变剪切的模式及不同剪切体可能对基因转录造成的影响，筛选组建乳腺炎低发病率牛群，培育乳腺炎抗性品系，是行之有效的技术手段之一。
　　补体系统，是体液免疫效应机制中一个重要的先天免疫调节系统，是存在于血浆和细胞表面上一组相互作用的复杂蛋白质，可以识别、结合并杀死入侵的微生物。补体系统具有经典途径、凝集素途径和替代途径三种激活途径，相互交叉相互配合发挥效应，三条途径最终形成膜攻击复合物（MAC）。MAC在靶细胞表面聚集介导溶胞效应，使跨膜穿孔以杀灭靶细胞。补体C6-9是终末途径的最主要成分，是溶膜复合体形成不可缺少的成分，对于自体免疫的防御机制以及免疫监视起重要作用，能抵抗病原微生物的侵染，消除病变衰老的细胞。据研究人补体C6-9基因具有丰富的多态性且与多个细菌的抗性相关，因而我们预测，牛补体C6-9基因也可能存在大量变异，且可能影响乳腺炎抗性。本实验研究了牛C6基因编码区外显子突变位点的多态性及与乳腺炎抗性的相关性，来判断C6基因可否作为腺炎抗性的候选基因。
　　可变剪切(S)是指由同一mRNA前体(Pre-mRNA)产生不同的剪切异构体的过程，通过可变剪切方式，一个基因可编码出多个不同的转录本，进而翻译成不同序列和结构的蛋白，导致单个基因可合成多个功能的蛋白功能。从整个人基因组的水平进行分析，发现人不同基因含有相当丰富可变剪切形式，推断牛补体C6-9可能存在不同的剪切体，分析了其在正常和患乳房炎组织当中mRNA水平，探讨其与乳腺炎发生的关系。
　　基因表达的最终产物是RNA和蛋白质，两者及其次级物质维持整个生命活动可以有条不紊的进行。所以基因表达调控的机理一直是研究的热点和前沿，在蛋白质编码的过程中，转录和翻译是两个最为重要的环节，而启动子的调控在基因转录环节中起关键作用。本研究中，我们预测并鉴定了C6-9基因启动子核心区域，筛选了启动子区存在的SNPs，分析了C9基因启动子区SNPs与乳腺炎的关联性及对启动子核心区的影响。
　　1．C6基因多态性与奶牛生产性状的关联性分析
　　本研究以469头中国荷斯坦奶牛为试验样本，利用DNA测序及PCR-RFLP等方法检测了牛C6基因中单核苷酸多态性(SNP)位点。并将发现的SNPs位点分型，统计了其等位基因及基因型的频率，分析了不同单倍型及单倍型组合与牛的生产性状的关联性，筛查出与奶牛产奶性状及乳腺炎抗性相关的分子标记，为培育高产、抗病奶牛提供参考依据。
　　经序列比对发现了4个SNPs：第2外显子上g.+2235G>A突变，第8外显子上g.+32881C>A和g.+32925C>T突变，第17外显子上g.+69060T>C突变，其中g.+2235G>A位点的碱基突变导致位于第71位的丝氨酸转突变为天冬氨酸， g.+32881C>A和g.+32925C>T突变分别引起第392位的组氨酸转变为谷氨酰胺，407位的丙氨酸变为缬氨酸，g.+69060T>C突变引起905位的甲硫氨酸转变为精氨酸。同时在试验群体中4个SNPs组成16种单倍型，符合统计分析数量的单倍型组合为10种。经过SAS软件统计分析发现，g.+32881C>A突变的群体， CA基因型的个体体细胞评分显著高于CC基因型的个体，且其产奶量显著低于CC个体；发生g.+69060T>C突变的个体，CC基因型的个体产奶量极显著高于TT基因型个体，且同时其乳蛋白率显著高于TT基因型个体。其他两位点发生突变的群体对所研究性状无显著性差异。H1H9(GCCT/ACCT)为乳腺炎抗性及高产奶量的最佳单倍型组合，而H2H2(GCCC/GCCC)个体体细胞评分明显高于其他单倍型组合个体，属易感性群体。
　　2. C6-9基因可变剪切体的鉴定
　　根据体细胞评分和奶样病原菌鉴定结果，将8头奶牛样本分为健康组和乳腺炎组。利用RT-PCR、QRT-PCR及基因克隆等技术，在肝脏、乳腺和脾组织中发现C6、C7和C9基因均存在不同于原基因序列的转录本，分别命名为C6-AS1、C7-AS1、C7-AS2、C9-AS1，将C6、C7、C9原转录本分别命名为C6-complete， C7-complete，C9-complete。其中C6-AS1的剪切模式为外显子跳跃：第5，6内含子和第6外显子完全缺失；C7-AS1第2-8外显子完全缺失，内含子完全保留；C7-AS2第6，7内含子和第7外显子完全缺失；C9-AS1的剪切模式为第6外显子发生部分缺失。发生剪切后，3个基因不同转录本的蛋白结构均发生了改变。
　　蛋白功能结构域的预测发现，C6、C7、C9发生剪切后，其蛋白的结构域发生较大变化，推测3个基因发生剪切后其蛋白质活性也发生了变化。本试验通过实时定量研究了C6、C7、C9基因不同转录本的mRNA在健康组和乳腺炎组中的表达情况，发现：C6-complete转录本在健康组织和患乳腺炎组织中表达差异显著；而C6-AS1转录本在两组织中表达极显著；两种转录本在健康组织中的表达差异显著，在患病组织中表达不显著。对于C7基因，C7-AS1转录本在两种组织中表达差异显著；在正常组织中， C7-complete和C7-AS1转录本表达差异显著。对于C9基因，两种转录本在两种组织中表达均不显著。
　　3. C6-9基因启动子核心区域的鉴定及分析
　　利用在线软件对C6-9基因5’调控区进行生物信息学预测，参考其结果设计相应的引物，成功构建了一系列载体并转染了 HepG2细胞，利用双荧光素酶报告基因检测系统分析了牛C9基因的5’侧翼区启动子活性。通过测序鉴定了该区存在1个SNP位点g.-2059C>T，分析了该SNPs对启动子活性的影响。结果在C6、C7、C8序列在编码区前2500个碱基处没有发现启动子区。推测C9基因的启动子核心区为 g.-526~ g.+4，与所预测结果较为吻合。相关性研究发现g.-2059C>T不同基因型个体之间与奶牛体细胞评分差异不显著，与C9浓度相关性研究后也没有发现其浓度发生显著变化。
　　综上所述，本研究选取补体 C6-9作为奶牛乳腺炎抗性候选基因，通过RT-PCR、QRT-PCR、 PCR-RFLP、测序、双荧光素酶的报告检测等技术筛查目标基因遗传多态性，同时结合奶牛的生产性能测定数据，分析候选基因遗传多态性与奶牛乳腺炎的关系。初步验证候选基因遗传多态性的功能，发现了与乳腺炎抗性相关的基因型。初步验证了不同转录本对编码氨基酸的影响，推测可变剪切对蛋白活性的作用。通过构建不同长度启动子区域的载体转染细胞系，验证了启动子的核心区域并对其功能进行了阐述，为奶牛乳腺炎抗性的分子标记辅助选择奠定理论基础。

目录

声明

英文缩写

第一章 文献综述

1奶牛乳腺炎及相关候选基因的研究进展

2可变剪切概述

3补体系统

4 研究的目的意义

第二章 C6基因的多态性研究

1材料与方法

2 试验材料

3 主要仪器设备和药品试剂

4 实验方法

5 聚丙烯酰胺凝胶电泳

6 数据统计分析方法

7 结果与分析

8 讨论

第三章 补体C6，C7，C9可变剪切体的鉴定与表达

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

第四章 C9基因启动子的克隆及活性分析

1材料与方法

2 试验结果

3 讨论

参考文献

致谢