松花粉硫酸酯化多糖对小鼠T淋巴细胞的免疫调节作用

摘要

本实验室毛华研究结果显示,用水煮醇沉法提取的马尾松花粉多糖经硫酸酯化修饰后能显著促进小鼠脾脏混悬细胞内钙离子浓度的升高,并且发现硫酸酯化多糖促进小鼠脾脏淋巴细胞[Ca2+]i升高与TLR4-PI3K-PLC信号通路有关。但是,对于硫酸酯化多糖作为一种分子量很大的化合物如何作用于T淋巴细胞,仍无文章报道。本实验从体外角度进行研究,对马尾松花粉多糖硫酸酯化修饰物(SPPM60)是否能引起小鼠脾脏T淋巴细胞内钙离子浓度升高机制进行初步研究,并研究其对T细胞产生细胞因子影响初步研究。实验主要分为以下几部分。 一、采用水煮醇沉法提取马尾松花粉粗多糖,用三氯乙酸法除蛋白质后,分别用40%、60%、80%的乙醇进行分级沉淀多糖。本实验选用60%乙醇沉淀的多糖组分用聚丙烯酰胺凝胶柱对多糖进行分离纯化,得一种较均一的组分。称取25mg PPM60用氯磺酸-吡啶法对其进行硫酸酯化,得到硫酸酯化多糖31.6mg。最后用氯化钡-明胶比浊法测定硫酸酯化多糖的取代度为1.2。红外光谱检测显示具有S=O和C-O-S的特征吸收峰,表明多糖硫酸酯化成功。 二、用尼龙毛分离T细胞,利用MTT法分别检测PPM60和SPPM60处理T细胞不同浓度、不同时间对T细胞增殖影响。结果发现200μg/mL的SPPM60作用48h对小鼠T细胞的促增殖效果最高,达15.7%。而PPM60对小鼠脾T细胞增殖作用较弱。 三、双波长荧光分光光度计检测利用SPPM60处理T细胞后,使T细胞内[Ca2+]i发生变化。与对照组相比SPPM60能使T细胞内[Ca2+]i显著升高。2-APB和U73122能极大抑制SPPM60引起的T细胞内[Ca2+]i升高。LY294002和维拉帕米也能部分抑制SPPM60-A引起的小鼠脾脏T淋巴细胞内[Ca2+]i升高。而TAK-242对其几乎没有影响。 四、用SPPM60或PPM60刺激T细胞后,再用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中IL-2、IL-4的分泌表达情况。结果显示200μg/mL的SPPM60处理48h时,上清中IL-4、IL-2的分泌水平均有所升高,当加入TAK-242后,再加SPPM60刺激,IL-2、IL-4的分泌情况与空白对照相比没有显著性变化。而加入2-APB后,则可以显著抑制SPPM60引起的T细胞IL-2和IL-4表达水平的升高。 以上结果表明: (1)研究小鼠脾脏T淋巴细胞时,发现PPM60对其有极弱的增殖作用,而多糖硫酸酯化后SPPM60则会有显著促增殖作用。 (2)猜测SPPM60促进小鼠T淋巴细胞的增殖可能是通过提高T细胞内[Ca2+]i来完成的。 (3)猜测SPPM60引起小鼠T淋巴细胞内[Ca2+]i升高与SOC通道以及TCR/CD3-PI3K-PLC信号通路有关。 (4)另外还发现SPPM60能使小鼠脾脏T淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-4的分泌水平明显上升。

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第一章 综述

1 多糖及其硫酸酯化多糖

2 脾脏T淋巴细胞的分离纯化

3T淋巴细胞表面受体研究

4T淋巴细胞内钙通道研究

5 胞内钙离子浓度变化对细胞因子产生的影响

6 多糖对T细胞细胞因子产生的影响

7、课题的目的意义

第二章 马尾松花粉多糖的提取、分离纯化及酯化

1 材料与试剂

2 仪器与设备

3 方法步骤

4 实验结果

5 讨论

第三章 多糖及酯化多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的影响

1 材料与试剂

2 仪器与设备

3 方法步骤

4 实验结果

第四章 多糖及酯化多糖对小鼠T细胞[Ca2+]i调控机制的初步研

1 材料与试剂

2 仪器与设备

3 方法与步骤

5 实验结果

6 讨论

第五章 多糖及酯化多糖对小鼠脾脏T细胞细胞因子产生的影响

1 材料与试剂

2 仪器与设备

3 方法步骤

4 实验结果

5 讨论

结论

展望

参考文献

致谢