二色补血草盐腺发育机制的初步研究

摘要

全世界的土壤盐渍化现象日趋严重,盐渍化土壤正在向耕地蔓延,经济发展、粮食和能源安全正面临着严峻的威胁。我国盐渍化土壤面积及次生盐渍化程度都高于世界平均值。传统工程学手段改造盐碱地存在很多弊端,易造成土壤次生盐渍化,成本巨大不利于可持续地改造盐碱地。所以,发展一种新的盐生植物用于抗盐机理研究,充分挖掘其潜在的抗盐基因,就显得尤为重要,对于提高农作物的抗盐水平和改良盐碱地意义重大。盐碱地中广泛分布的泌盐盐生植物具有典型的盐腺和盐囊泡,是区别于其他盐生植物和所有非盐生植物唯一可见的结构特点,可以将体内过量积累的盐离子排出体外从而避免了盐胁迫,这种泌盐盐生植物就提供了良好的抗盐性研究材料。
　　从上世纪50年代开始,泌盐盐生植物的研究大部分集中于盐腺结构和泌盐机理上,但是探讨盐腺真正的抗盐机理关键在于盐腺的发育机制,从根本上揭示盐腺的发育机制对于真正解释盐生植物耐盐机理、培育耐盐作物、进而改良盐渍化土地具有重大意义。本研究利用具有典型盐腺的二色补血草(Limonium bicolor)为实验材料,从细胞生物学和分子生物学两个方面探索盐腺的发育机制,旨在研究盐腺的分化方式和筛选控制盐腺发育的关键基因。
　　培育二色补血草为一种研究抗盐性的模式盐生植物,面临着一系列瓶颈问题:高效遗传转化体系的建立;饱和突变体库的获得;缩短生长周期以及能否自花授粉获得纯合突变体;全面的基因组/转录组注释等等。本论文针对如上问题进行了探索,主要结果如下:
　　1.构建了以二色补血草叶片为外植体的农杆菌介导的遗传转化体系
　　首先设计不同种类及浓度的生长调节剂配比,以无菌培养1个月的二色补血草六叶期幼苗的叶片为外植体,筛选最佳再生培养条件,获得最佳芽再生培养基是MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L NAA,再生率达到96％以上,最适根再生培养基是MS+0.5mg/L IBA。然后探索了根癌农杆菌侵染的各个参数设置,采用含有pTCK303质粒的EHA105菌株,携带有GUS报告基因以及潮霉素抗性基因等,侵染浓度为0.6-0.7(OD600),经与叶片共培养4天后,置于筛选培养基中培养获得转基因植株,芽筛选培养基在芽再生培养基的基础上添加8mg/L潮霉素和600mg/L哌拉西林钠,根筛选培养基是根再生培养基中添加8mg/L潮霉素。对转基因植株进行GUS染色后呈现阳性,结合定量PCR检验和northern杂交的阳性检验结果,我们获得转基因效率为4.43%。高效的遗传转化体系为将来的转基因验证盐腺发育及泌盐基因的功能提供了保障,使二色补血草盐腺发育的研究具有了可行性。
　　2.获得了盐腺发育及泌盐的突变体,确定了二色补血草花的授粉方式
　　利用EMS化学诱变和60Cogamma辐射诱变两种方式,探索适合于二色补血草种子的最佳诱变处理方法,由于EMS化学诱变引起的单碱基对的改变,并未获得盐腺发育的突变体,但是在gamma射线120Gy的剂量下可以获得盐腺发育的突变体,辐射诱变约30,000粒种子,经自发荧光筛选鉴定后获得19株盐腺发育异常的突变体M0代,经叶圆盘分泌检测后进一步鉴定出泌盐能力显著增加/减少的突变体。由于自交才有可能最大程度的保存突变体性状,所以本论文同样讨论了二色补血草花的授粉方式,经单株隔离后,观察花粉管的萌发情况和收获种子能力,我们鉴定二色补血草具有自花授粉的能力,单株获得约200粒种子,为突变纯合体的筛选奠定了基础,盐腺发育及泌盐突变体为后期验证盐腺发育及泌盐的关键基因提供了材料准备,也为以后创建二色补血草盐腺发育及泌盐饱和突变体库奠定了基础。
　　3.确定了二色补血草叶片及盐腺的分化模式
　　利用两个典型的发育时期,生长一个月的幼嫩六叶期和三个月的成熟大叶期叶片,探索二色补血草叶片及盐腺的分化模式。对于同一叶片而言,随着叶面积的不断伸展,盐腺密度不断下降,盐腺密度与叶面积的增长呈反比。不同叶位的叶片盐腺的分布规律:随着叶位的不断上升,单个叶片的盐腺总数呈上升的趋势。二色补血草叶片的盐腺泌盐速率和盐腺分泌总量,均与叶面积的增加呈正比。
　　我们进一步观察分化早期的叶片及子叶上盐腺的发育方式,证实盐腺的起始细胞是盐腺母细胞经辐射对称分裂形成可见的四细胞结构,最后形成十六细胞的结构。通过子叶和真叶的分化跟踪发现,盐腺的分化成熟早于气孔2天,子叶上的盐腺四细胞结构与气孔的拟分生组织的结构共存,直到盐腺分化成熟才开始气孔的分化。非损伤微测的结果显示,真叶上的盐腺一旦分化成熟就具有了较强的分泌能力,这样就为二色补血草的幼苗早期抗盐性提供了保障。
　　利用微分干涉差显微镜和透射电子显微镜对第一片真叶的分化跟踪,发现第一片真叶的分化共经历了5个时期:未分化时期、盐腺分化时期、气孔分化时期、表皮细胞分化时期和成熟期,每个时期均有特异的时间段,而且各个发育时期有明确的时间间隔,与子叶分化模式不同的是,在盐腺分化成熟后气孔拟分生组织开始出现并迅速分化为成熟气孔。对叶片不同发育时期的盐腺超微结构的观察显示,二色补血草盐腺具有明显的结构特点:外被加厚的角质层;盐腺细胞之间以及盐腺和叶肉细胞之间大量的胞间连丝;巨大多嵴的线粒体;大量的小囊泡积累(没有中央大液泡);没有叶绿体;具有独特的自发荧光现象;而且随着分化时间的延长,线粒体更加发达,胞间连丝和小囊泡剧烈增加,出现大量的囊泡与细胞膜融合的现象。
　　4.二色补血草叶片发育转录组的构建
　　基于叶片发育的不同时期的划分,本研究进一步进行了叶片发育的转录组测序,分别大量富集二色补血草5个发育时期的真叶,提取纯化mRNA后,构建cDNA文库,利用Illumina HiSeq2000测序仪进行测序,产生双向各100bp的测序读长,经denovo拼接后与Nr数据库(non-redundant protein database)进行比对注释后,利用DEseq方法筛选到各时期的差异表达基因共4,696个,K-means聚类后获得16个具有不同发育时期特异性的cluster,而且DAVID分析显示各cluster具有不同的功能富集。集中分析盐腺发育时期和未分化时期的差异表达基因,共发现72个基因可能与盐腺的发育有关,随机选取26个拼接的转录本,通过Real-time PCR证实与转录组的结果相关性较高,利用盐腺发育增加的突变体同样验证了这些基因参与了盐腺的分化。针对未分化时期的差异表达基因分析显示控制盐腺的分化基因与腺毛具有较高的同源性,而且盐腺的分化方式同样暗示了与腺毛具有类似的发育模式,据此我们推测,盐腺与腺毛具有共同的起源。
　　5.利用叶片盐腺泌盐转录组,筛选既参与盐腺分化又决定泌盐能力的关键基因
　　利用200mM NaCl处理下具有明显泌盐表型的二色补血草成熟叶片,构建叶片泌盐转录组。经拼接后与Nr数据库注释后,利用Dexus方法获得处理组和对照组之间的差异表达基因5,768个,对泌盐转录组的分析显示92个基因可能参与二色补血草盐腺泌盐,包括囊泡运输基因、各类离子转运载体、ROS清除系统和ABA等信号转导途径相关的基因,以及部分转录因子,经17个转录本的体外qRT-PCR验证发现与转录组结果相关性较好,而且泌盐能力增加和减少的突变体同样验证了关键的泌盐基因。除此之外,经与盐腺不同发育时期的转录组比较后,共发现51个基因可能既参与盐腺的发育过程,又与盐腺的泌盐密切相关,这些盐腺发育及泌盐的基因库为探索盐腺发育及泌盐的分子机制提供了可靠的背景数据,为将来确定并验证盐腺发育的关键基因奠定了基础。
　　论文的主要创新点:
　　1.构建了二色补血草根癌农杆菌介导的叶片遗传转化体系,转化效率为4.43%,为转基因验证及确证盐腺发育的关键基因奠定了基础。
　　2.发现二色补血草盐腺具有独特的自发荧光现象,并利用这种方法首次筛选到大量的盐腺发育及泌盐的突变体,并证实二色补血草可以实现自花授粉以保存突变体性状。
　　3.揭示二色补血草子叶上存在盐腺,并探讨其分化模式,为解释二色补血草幼苗的早期抗盐提供了依据。在个体水平上解释盐腺的分布规律是,随叶位的不断增加,单个叶片的盐腺密度及盐腺总数都呈增加的趋势。
　　4.确定二色补血草第一片真叶上盐腺的分化划分为5个明显的阶段:未分化时期、盐腺分化时期、气孔分化时期、表皮细胞分化时期和成熟期,盐腺分化阶段具有明显的时间段,是二色补血草表皮上最早分化成熟的结构,比气孔早成熟2天。
　　5.首次构建了二色补血草盐腺发育的基因背景数据库,其中72个基因可能与盐腺的发育有关,92个基因可能参与二色补血草盐腺泌盐,51个基因可能既参与盐腺的发育过程,又与盐腺的泌盐密切相关;并发现盐腺和腺毛具有高度的同源性,两者可能有共同的起源,而囊泡运输可能是盐腺泌盐主要方式。

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中文摘要

英文摘要

英文缩写符号及中英文对照表

第一部分 文献综述

1. 盐生植物(泌盐盐生植物)研究

1.1 土壤盐渍化改良现状

1.2 泌盐盐生植物研究

1.3 二色补血草是一种具有典型盐腺的泌盐盐生植物

2. 植物表皮发育研究进展

2.1 腺毛发育进展

2.2 气孔发育进展

3. 研究植物细胞发育常用的手段

3.1遗传转化转基因验证——最佳再生及转化培养基的建立

3.2 获得发育突变体——突变体创制的研究

3.3 高通量转录组测序为筛选控制盐腺发育的关键基因提供了新的手段

4. 论文选题的目的及意义

第二部分 实验论文

第一章 二色补血草高效遗传转化体系的建立

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨 论

第二章 二色补血草盐腺发育及泌盐突变体的获得

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨 论

第三章 盐腺在不同发育时期叶片的分布规律及泌盐能力的测定

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨 论

第四章 二色补血草盐腺发育方式的确定

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨 论

第五章 利用高通量转录组测序筛选控制二色补血草盐腺发育的基因

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨 论

第六章 基于叶片发育的转录组文库，利用高通量转录组测序筛选盐腺泌盐关键基因

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨 论

第三部分 总结与展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间整理发表的论文

致谢