FAAP基因敲除小鼠模型的构建和表型初步分析

摘要

粘着斑相关蛋白（FAAP，focal adhesion associated protein）是由小鼠D10Wsu52e基因编码的分子量为55kD的蛋白，进化上非常保守，在细菌、古生菌和后生动物中广泛分布。在小鼠不同组织中的表达分析发现，FAAP在生殖器官中高表达，推测其是一个与生殖系统紧密相关的基因。为探索FAAP在雄性生殖系统中的功能，本实验运用反转录PCR及Western Blot研究了FAAP在雄性生殖系统中的表达模式。结果显示，FAAP mRNA在睾丸、附睾、输精管、前列腺中都检测有表达，在精囊中未检测到其表达，而睾丸和附睾中FAAP的表达量高。Western Blot检测C57BL/6J雄性小鼠出生后第1、7、14、21、28、35、42天附睾及睾丸中FAAP蛋白表达量发现，FAAP蛋白的表达量随出生后天数而逐渐增加。这表明FAAP可能在小鼠附睾形态发育、功能维持和精子成熟中起作用。实验可以作为 FAAP基因敲除小鼠的野生型对照组来观察敲除组和野生型不同发育时期附睾和睾丸中FAAP的表达变化，进而为观察不同发育时期小鼠的附睾形态、精子形态和受精能力做铺垫。
　　利用基因打靶技术构建FAAP基因敲除小鼠模型：KO（knockout)-First基因敲除小鼠模型。KO-First是一种多用途的模型，与条件敲除策略类似，在靶片段的两侧分别放置方向相同的loxP位点，同时还在靶片段5’端内含子中放置一个两侧带有FRT位点的SA-IRES-reporter片段。这样的模型可以用靶基因的启动子表达报告基因（reporter），通过检测报告基因的表达即可了解靶基因的表达情况；与表达Flp的工具鼠交配可去除 SA-IRES-reporter片段，得到常规的flox小鼠。KO First模型的flox小鼠与conditional KO模型的flox小鼠不同，conditional KO中的flox小鼠表型正常，但KO First却是KO表型。所以通过检测 KO-First小鼠表型分析可以初步检测FAAP KO表型。本实验所用的KO-First小鼠是插入了FRT-lacZneo-FRT-loxP元件及 loxP位点的基因敲除小鼠，带有LacZ报告基因，可用LacZ染色定位检测报告基因了解FAAP的表达情况，结果显示，在KO-First小鼠的大脑和睾丸附睾中FAAP的表达量高。通过KO-First小鼠与C57BL/6J小鼠检测繁殖力发现，与C57BL/6J雄鼠相比，KO-First小鼠受孕率明显降低。KO-First小鼠后代从出生后14天左右开始出现死亡,在出生后第28天至42天存活率低，很少有活过2个月的。表明 FAAP在小鼠生长发育过程中起了重要作用。FAAP KO First小鼠可与 Flper小鼠交配后去除FRT-lacZneo-FRT元件，得到常规的FAAP flox小鼠。FAAP flox小鼠与Defb41iCre/wtCre小鼠交配即可获得在附睾特异性敲除FAAP的条件敲除小鼠。
　　本实验利用KO-First基因敲除小鼠模型，可以进行FAAP基因敲除小鼠初步的表型分析，为定向敲除附睾起始段中FAAP的表达做铺垫；可以检测FAAP对精子成熟的影响，检测 FAAP在小鼠雄性生殖系统中的作用，为研究开发新的避孕药物及治疗男性不育奠定理论基础。

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第一部分 背景介绍

1 粘着斑相关蛋白（ FAAP ， focal adhesion associated protein）

2 基因敲除小鼠模型

第二部分FAAP在小鼠不同组织中的表达

1材料

2 方法

3 结果

4讨论

第三部分 构建基因敲除小鼠模型和表型初步分析

1材料

2方法

3 结果

4讨论

结论

1. FAAP在小鼠睾丸、附睾中高表达

2.建立FAAP基因敲除小鼠--FAAP KO First小鼠模型

3. KO First小鼠 表型初步分析

4.鉴定Defb41iCre/wtCre小鼠

参考文献

附录

致谢