中国荷斯坦牛HIBADH和TNP1基因的遗传变异及其对精液品质影响的研究

摘要

本课题研究对象是公牛的HIBADH和TNP1基因，重点鉴定它们功能区的遗传变异，筛选与公牛精液品质密切相关的功能性分子标记，并尝试探究这些遗传变异可能的分子调控机理，为未来培育高繁殖力的公牛提供参考及依据。
　　1.中国荷斯坦公牛HIBADH基因核心启动子、功能性SNPs及甲基化的探究
　　本研究首先通过western blot、免疫组化，发现HIBADH在公牛睾丸和附睾中均有表达。免疫荧光进一步验证HIBADH集中表达于精子中部和颈部，少量表达于头部。考虑到大量线粒体聚集在精子中部，提供能量，使鞭毛运动。我们初步猜测HIBADH可能与精子活力有关。随后扫描HIBADH基因5'侧翼区SNPs，发现g.-165 T>C突变。关联分析发现g.-165 T>C-CC基因型的个体鲜精活力显著低于TT基因型个体(P<0.05)。生物信息学预测此突变位于HIBADH基因的核心启动子区，推测可能影响启动子区的活性。启动子缺失片段实验表明HIBADH核心启动子区域处于-703bp~+175bp处。将含有TT、CC基因型的启动子片段分别连接pGL3-Basic，转染表明TT基因型有最高的启动子活性。g.-165 T>C突变后增加了转录因子E47结合位点。核心启动子区甲基化试验表明高和低精子活力两组甲基化水平差异不显著（P>0.05），均呈现的是低甲基化态势。但是高活力组 CpG岛第7位点基本都呈现甲基化的状态，极显著的高于低活力组（P<0.01）。这种特殊模式作用机制尚不清楚，需进一步探究。综上所述，我们推测启动子区功能性SNP（g.-165 T>C）可以调控HIBADH基因表达，进而影响公牛精子活力，核心启动子区域甲基化模式可能并非起主要的作用。
　　2. Bta-miR-204和bta-miR-532与中国荷斯坦公牛TNP1基因3’UTR的相关探究
　　公牛TNP1基因的3’UTR区探测到2个多态性位点，分别是g.442 A>G和g.528 G>A。分析表明，g.528 G>A-GG基因型的个体精子畸形率显著比 AA和GA基因型个体低(P<0.05)；而g.442 A>G对公牛精液品质影响不显著。单倍型组合分析表明，H1H3和H1H1型公牛的精子畸形率显著比其他单倍型组合个体低(P<0.05)。
　　由于 g.442 A>G和g.528 G>A均位于3’UTR区，我们推测它们可能通过相应的miRNAs发挥相应的调控作用。
　　miRNAs预测软件发现bta-miR-204和bta-miR-532可以与公牛TNP1基因3’UTR结合，且g.442 A>G和g.528 G>A分别存在于结合靶序列内。构建bta-miR-204质粒，β-gal质粒，以及包含g.442 A>G野生型和突变型的3’UTR表达质粒共转MLTC-1细胞；同时构建bta-miR-532质粒，β-gal质粒，以及包含g.528 G>A野生型和突变型的3’UTR表达质粒共转MLTC-1细胞。结果与cmir0001-MR04对照相比，荧光活性降低。表明bta-miR-204和bta-miR-532可以和公牛TNP1基因3’UTR结合，降低TNP1的表达，并且g.442 A>G和g.528 G>A突变后增加了两个miRNAs与靶序列结合能力，使TNP1表达量更低。我们又构建分别含H1，H2，H3和H4四种单倍型的3’UTR表达质粒，将它们分别与bta-miR-204质粒，β-gal质粒，bta-miR-532质粒，共转MLTC-1细胞。结果单倍型H4有最高的miRNAs结合能力，显著高于单倍型 H1（P<0.05）。Q-PCR方法检测不同单倍型组合个体 TNP1 mRNA的含量，揭示H1H1个体mRNA水平显著高于H4H4个体（P<0.05）。Q-PCR结果与单倍型试验结果一致。此外，bta-miR-204和bta-miR-532在性成熟牛的睾丸组织中的表达量比性未成熟牛的睾丸组织分别下调1.6和5倍。总上所述，TNP1基因3’UTR的两个SNPs均可影响bta-miR-204和bta-miR-532与TNP1基因3’UTR区的结合能力，调节TNP1的表达，继而影响种公牛精液品质，是功能性的位点。
　　3. HIBADH基因多态性与中国荷斯坦公牛精液品质的相关性
　　我们选取404头公牛样本，利用PCR-RFLP、直接测序等技术扫描HIBADH基因全序列，进行多态性分析。
　　在公牛HIBADH基因中发现了2个SNPs位点，分别是g.26736 T>C和g.90209 C>T。g.26736 T>C位于内含子4上；g.90209 C>T位于外显子5上，突变前后，第165位氨基酸未发生改变，故为同义突变。分析表明，g.26736 T>C位点的TC基因型个体鲜精活力显著高于TT和CC基因型个体(P<0.05)；g.90209 C>T与冻后活力关系紧密，CC基因型个体冻后活力显著比TT个体高(P<0.05)。单倍型构建分析，发现4种单倍型和9种单倍型组合。H1H3的鲜精密度、鲜精和冻后活力显著比其他单倍型组合高(P<0.05)。因此，H1H3是优质单倍型组合，是有效分子标记，将来可参与辅助育种。

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第一章 文献综述

1公牛精液品质的研究概况

2 HIBADH基因的概况

3 TNP1基因的概况

4启动子的概况

5 miRNA的概况

6单核苷酸多态性的研究概况

第二章中国荷斯坦公牛HIBADH基因核心启动子、功能性SNPs及

1 实验的材料和试剂

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第三章Bta-miR-204 和bta-miR-532与中国荷斯坦公牛TNP1基因

1 实验的材料和试剂

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第四章HIBADH基因多态性与中国荷斯坦公牛精液品质的相关性

1 实验的材料和试剂

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文

附录1

附录2