色盐杆菌DSM22428T新种鉴定及其甜菜碱醛脱氢酶研究

摘要

菌株DSM22428T是本实验室从东营滨海盐地碱蓬分离的一株内生中度嗜盐菌，其可生长的NaCl浓度范围为0.6–20％（w/v），比嗜盐古菌有更广的耐盐范围，对外界盐浓度的剧烈变化有更好的适应性。本实验室的前期研究证实，菌株DSM22428T在高盐条件下可通过在细胞内积累渗透保护剂甘氨酸甜菜碱来抵抗外界的渗透胁迫，维持细胞内外渗透平衡。甘氨酸甜菜碱是细菌，植物，动物最有效的无毒渗透保护剂，目前已经对植物中的betB进行了深入研究，且为植物抗逆工程的重点。BADH基因序列在不同的物种中有较大差异，因此赋予菌株抗渗透胁迫能力也不相同。细菌以胆碱为底物经胆碱脱氢酶CDH和甜菜碱醛脱氢酶BADH催化合成甘氨酸甜菜碱，而甜菜碱醛脱氢酶BADH是甘氨酸甜菜碱合成的关键酶。此外，甜菜碱醛脱氢酶还在病原菌入侵宿主时发挥重要的作用。因此对DSM22428T甜菜碱醛脱氢酶的酶学性质进行研究有助于深入了解甜菜碱醛脱氢酶的特点，对于进一步明确该菌的抗盐机理有重要意义。同时经前期研究发现菌株DSM22428T应属于色盐杆菌属的一个新种，相关鉴定工作已经开展。但是随着分子鉴定在细菌新种鉴定中的作用越来越大，DNA杂交、脂肪酸、极脂分析等已经成为必要的项目，因此对DSM22428T进行更多的分子鉴定对于确定其在盐单胞菌科中的分类地位是十分必要的。
　　本文首先将色盐杆菌DSM22428T甜菜碱醛脱氢酶基因betB在大肠杆菌中进行了异源表达及功能验证，然后进行了酶的纯化及酶学性质研究，最后对色盐杆菌DSM22428T进行了新种的鉴定。具体实验结果如下：
　　1.根据 GenBank中色盐杆菌DSM22428T甜菜碱醛脱氢酶基因 betB序列，设计一对上下游引物，以色盐杆菌DSM22428T总DNA为模板扩增获得 betB基因的全序列，双酶切后连接到表达载体 pET-15b上，转化大肠杆菌 BL21(DE3)，在重组大肠杆菌中成功进行了甜菜碱醛脱氢酶的异源表达。在不同 NaCl浓度梯度基本培养基中添加终浓度为1mM的胆碱，接种色盐杆菌DSM22428T，结果发现和对照相比，在盐胁迫条件下，外界提供一定浓度的胆碱，可以明显提高野生菌株的耐盐能力，说明野生菌株甜菜碱醛脱氢酶具有明显的渗透调节功能。为了进一步验证异源表达的甜菜碱醛脱氢酶是否具有渗透调节功能，在不同 NaCl浓度梯度的LB培养基中添加终浓度为1mM的胆碱，接种重组大肠杆菌，用IPTG诱导表达，结果发现带有 betB基因的重组大肠杆菌生长速度远高于带空质粒的对照组，尤其在高盐条件下效果更加明显，色盐杆菌DSM22428T甜菜碱醛脱氢酶基因 betB的导入显著提高了重组大肠杆菌的耐盐性，说明异源表达的色盐杆菌DSM22428T甜菜碱醛脱氢酶同样具有渗透调节功能。
　　2.用0.3mM的IPTG低温诱导重组大肠杆菌过量表达甜菜碱醛脱氢酶蛋白，高压匀浆机破碎菌体细胞，并通过镍柱亲和层析、离子交换层析、分子筛柱层析进行蛋白纯化。最终得到了较纯的目的蛋白，蛋白浓度约为1.5mg/ml，单体分子量在61KDa左右，与生物信息学分析的DSM22428T甜菜碱醛脱氢酶分子量相同。
　　3.将提纯的甜菜碱醛脱氢酶进行酶学性质研究，经测定酶的最适pH为7.5，酶的比活为3.6×10-2 U/mg。同时研究发现该酶具有耐盐性，盐浓度为2M时，该酶仍保留40%左右的酶活，说明该酶具有较强的抗高盐浓度的能力。
　　4.按照 Halomonadaceae科菌种鉴定的最小标准对菌株 DSM22428T进行分类学研究。菌株DSM22428T盐浓度生长范围为0.6–20%（w/v）（最适盐浓度为5-6%，w/v），生长温度为5-45 oC(最适温度为35℃)，生长 pH范围为5-9(最适 pH为7-8)，可积累聚-β-羟丁酸和产胞外多糖。主要含有的脂肪酸为 summed feature3(C16:1ω7c/C15:0 iso2-OH，23.1%)，C18:1ω7c(22.6%)和C16:0(22.3%)。主要的呼吸醌为泛醌 Q-9(86%)。主要的极性脂为：磷脂酰乙醇胺 PE；磷脂酰甘油PG；一种未知糖脂GNL；一种未知糖磷脂PGNL；双磷脂酰甘油DPG；一种未知脂类L；一种未知氨基脂AL。16S rRNA基因序列及级联的16S rRNA，gyrB，rpoD基因序列系统发育分析显示菌株DSM22428T属于色盐杆菌属的新种。其最相近菌株为Chromohalobacter israelensis DSM6768T(95.4%16S rRNA序列相似性)。菌株DSM22428T与 C. israelensis DSM6768T，C. salexigens DSM3043T，C. beijerinckii DSM7218T，C. canadensis DSM6769T，C. nigrandesensis DSM14323T，C. sarecensis DSM15547T DNA–DNA杂交值范围为15%±2%-43%±1%。根据形态和生理特征及系统发育分析证明菌株DSM22428T代表了色盐杆菌属的新种。

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第一章 文献综述

1.1 甜菜碱醛脱氢酶的研究概况

1.2 细菌分类鉴定方法

1.3 Halomonadaceae 科的研究概况

1.4 Chromohalobacter 属的研究概况

1.5 本研究的立题依据、研究内容及技术路线

第二章 甜菜碱醛脱氢酶异源表达及其功能分析

2.1 实验材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 本章小结

第三章 重组甜菜碱醛脱氢酶的提取与纯化

3.1 实验材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 本章小结

第四章 甜菜碱醛脱氢酶的性质研究

4.1 实验材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 本章小结

第五章 菌株DSM 22428T新种鉴定

5.1 实验材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 本章小结

参考文献

致谢