鲤鱼(Cyprinus carpio L.)IgT介导的粘膜适应性免疫应答的研究

摘要

鱼类是最早具有免疫球蛋白的脊椎动物，适应性免疫对鱼类防御病原菌感染具有重要的作用。同时，由于其特殊的水生生活环境，鱼类的粘液性免疫非常发达，在粘膜相关淋巴组织及其粘液中分布着大量的免疫球蛋白。这些存在于系统免疫器官和粘膜免疫组织中的抗体共同发挥着特异性免疫的保护作用。相比于哺乳动物，鱼类粘膜特异性抗体的发现较晚，对其免疫作用机制及其与IgM之间的关系并不清楚，作为两类独立的淋巴细胞亚群，其抗体分泌细胞的作用和功能仍然需要更多的研究和探讨，对鱼类免疫球蛋白的研究有助于我们进一步认识免疫系统的进化和发生。
　　鲤鱼是我国重要的经济鱼类，嗜水气单胞菌是我国水产养殖中常见的病原菌之一，通过免疫的方法预防和控制养殖过程中的病害发生具有十分重要的意义，对鲤鱼抗体介导的免疫应答的研究有助于选择正确的免疫预防策略。IgT（IgZ）是近年来新发现的鱼类免疫球蛋白类型，在鱼类粘膜组织中发挥着重要的特异性免疫防御作用。本实验进行了浸泡免疫后鲤鱼头肾和后肠转录组测序，并在此基础上，以实验室前期克隆得到的鲤鱼IgT分子为研究对象，探讨其在嗜水气单胞菌刺激鲤鱼过程中的免疫应答变化，并对鲤鱼IgT+B细胞进行了定位观察。
　　实验首先对嗜水气单胞菌浸泡免疫刺激后头肾和后肠组织进行了转录组测序和分析。通过测序，共得到Unigene139,751个，采用NR、GO、eggNOG、Swiss-Prot四个数据库进行基因功能注释，分别获得功能注释基因61,585，33,091，58,807，49,696个，注释序列占Unigene的比例为23.68％~44.07%。通过对浸泡免疫刺激后第3天和第7天头肾和后肠转录组测序数据的比较，分析了嗜水气单胞菌浸泡后鲤鱼两种组织转录水平的差异表达基因。差异表达unigene的GO分析和KEGG分析结果表明，两种组织中被活化的生物学通路是不同的，补体和凝集素信号途径是头肾中显著活化的通路，此外还包括Toll样受体、NF-κB以及TNF相关的信号通路。而在后肠中则是参与抗原处理和递呈的通路被显著活化，并且不同时段取材的后肠组织中，该通路的活化程度不同。此外，细胞粘附信号通路出现于肠组织Unigene最显著富集的KEGG pathway中。在此基础上，本实验又进一步筛选了头肾和后肠转录组中与免疫球蛋白相关的unigene，结果发现，头肾中具有IgM和IgZ的同源序列，后肠中具有IgZ的同源序列，并且后肠转录组中Ig重链可变区的unigene更丰富，可变区unigene的增多和表达升高与肠道直接接触病原菌进而识别抗原表位的功能是相适应的。转录组测序结果为进一步研究鲤鱼IgT在粘膜适应性免疫中的作用提供了基础。
　　转录组测序分析表明，浸泡刺激方式下IgZ在鲤鱼头肾和后肠组织均表达，但是其抗原结合活性和活化的信号通路是不同的，因此，为了进一步确定鲤鱼IgT在这一过程中的免疫功能，本实验采用注射和浸泡嗜水气单胞菌两种免疫刺激方式，比较分析在不同刺激方式下鲤鱼各免疫相关组织中 IgT和 IgM在转录水平的表达变化。实时荧光定量PCR检测发现，IgM和IgT在头肾、脾脏、肠道及肝脏中表现出不同程度的免疫应答反应，但是其表达变化的特征不同。与 IgM相比，IgT在肠道组织中的表达倍增更显著，尤其在浸泡组后肠。因此，鲤鱼IgT在抗体介导的肠道粘膜组织特异性免疫应答中发挥着主导作用。其次，对比两种分子 IgT和 IgM的表达变化，可以发现，IgM基础表达量较高，虽然在刺激后表达倍增值普遍低于IgT，但是其绝对表达量并不低。本实验又制备了IgT-CH3区蛋白的单克隆抗体，运用 IgT单克隆抗体以及 IgM单克隆抗体对免疫应答不同阶段的鲤鱼头肾、脾脏和后肠组织 IgT和 IgM的表达进行了 western-blotting检测。实验结果表明，鲤鱼 IgT和 IgM的免疫活化过程是不同的，IgM可能更多的以组成型表达的方式发挥作用，而IgT具有较强的免疫应答变化。同时，后肠是IgT产生特异性免疫应答，发挥免疫功能的重要位点。
　　为了进一步认识IgT+B细胞在组织中的分布，本实验通过IgT单克隆抗体对头肾、脾脏以及后肠组织中IgT+B细胞进行了标记。实验结果可见，IgT+B细胞在头肾和脾脏中均有分布，并且在免疫刺激后的组织中，其阳性信号增强。对IgT+B细胞进一步的酶标免疫组化显示，该阳性细胞既出现于头肾和脾脏的黑色素巨噬细胞中心，也出现于该中心以外的其他区域。而后肠组织中，IgT+B细胞在粘膜上皮细胞层和粘膜固有层都有分布，但是在粘膜固有层中的出现较晚，这可能与IgT+B细胞在后肠组织中的募集过程有关。
　　综上所述，鲤鱼免疫球蛋白在系统免疫和粘膜免疫中都具有重要的作用，IgT作为肠道中具有较强免疫反应的抗体分子，能够产生针对嗜水气单胞菌的特异性免疫应答，表现出与IgM不同的应答特征。对IgT免疫功能的研究有助于我们更深入的认识鱼类抗体介导的特异性免疫机制，并为进一步研究鱼类B淋巴细胞的分化和功能提供基础资料。

目录

声明

第一章综述

1.1鱼类免疫球蛋白研究进展

1.2鱼类Ig阳性B淋巴细胞研究进展

1.3 鱼类肠道粘膜免疫研究进展

1.4本论文的研究目的和意义

第二章浸泡免疫鲤鱼头肾和后肠转录组学研究

前言

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3 实验结果

2.4讨论

第三章免疫刺激对鲤鱼IgT、IgM及其受体分子表达的影响

前言

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3 实验结果

3.4讨论

前言

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4讨论

结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表文章