基于Au-Se键的纳米荧光探针的设计合成及生物应用

摘要

由于纳米金颗粒有良好的生物相容性，较低的毒性，以及独特的光电可调性等特点，基于传统的Au-S 共价键设计的纳米金生物传感已经被广泛应用于各种生物分子的检测。在 1996年 Storhoff ’s 课题组和 Schultz's课题组首次提出这种通过 Au-S共价键在纳米金粒子表面组装上 DNA的纳米生物技术。此后，人们将越来越多的纳米材料以及生物材料，包括各种 DNA，RNA，多肽以及其他分子物质，通过 Au-S共价键修饰在纳米金粒子的表面形成各种各样的纳米荧光探针，用于生物成像和分子检测。然而，在生物体内尤其是肿瘤细胞内含有丰富的硫醇物质，比如谷胱甘肽，当在生物系统中应用这种以 Au-S 共价键为基础的纳米金生物传感时，硫醇修饰的功能化识别单元很容易被谷胱甘肽取代，从而导致检测信号的失真，引起肿瘤诊断的假阳性结果。如何解决探针在实际应用过程中遇到的生物硫醇的干扰问题，一直是一个巨大的挑战。基于此，我们设计了两种新型的基于 Au-Se 键的纳米荧光探针，用来实现高硫醇环境下肿瘤标志物的检测与生物成像。这种具有抗谷胱甘肽能力的Au-Se 键纳米荧光探针为生物和医学领域的研究提供了可靠的检测手段。 本论文的主要研究内容包括以下两部分： 1、我们设计合成了一种新型的基于 Au-Se 键的纳米荧光探针，用来实现高硫醇环境下肿瘤细胞内MMP-2的检测与生物成像。通过在金属蛋白酶MMP-2特异性识别的肽链一端分别接上半胱氨酸和硒代半胱氨酸，首次构建了 Au-S键纳米探针（Au-S-peptide-FITC）（FITC，Fluorescein isothiocyanate）和Au-Se键纳米探针（Au-Se-peptide-FITC），实现了肿瘤细胞内MMP-2的精准检测。实验结果表明，与传统的Au-S键探针相比，Au-Se 键纳米荧光探针具有非常好的热稳定性，并且在模拟生理条件下，对谷胱甘肽具有很好的抗干扰能力。更重要的是，细胞内巯基类物质被清除前后，Au-Se 键纳米荧光探针对胞内 MMP-2的荧光响应信号没有发生明显的变化，获得的荧光信号真实地反映了 MMP-2 水平。因此，具有抗谷胱甘肽能力的Au-Se 纳米传感的构建必将为生物和医学领域重要分子的检测提供更为可靠的方法。 2、基于新型的Au-Se 键纳米探针具有非常好的热稳定性，以及对生物硫醇具有很好的抗干扰能力，我们进一步合成了双检测的Au-Se 键纳米荧光探针，用于 MMP-2 和MMP-7两种金属蛋白酶的同时检测与成像。我们在纳米金粒子表面通过Au-Se键修饰上用 FITC 标记的肽链和用 Carboxytetramethylrhodamine（TAMRA）标记的肽链，荧光团FITC的发射为520 nm，可以有效地与TAMRA的发射（582nm）分开，从而可以在共聚焦中实现双通道的同时检测。实验结果表明，探针稳定性好，反应比较迅速，在体内或者体外可以同时检测 MMP-2和 MMP-7。在生理条件下，该探针不仅可以避免生物硫醇的干扰，而且还可以避免单一肿瘤标志物引起的假阳性结果，进一步提高探针的选择性。这种双重作用，使得该探针可以专一靶向目标分子，从而实现肿瘤的准确诊断。

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