野生花生全基因组SSR标记的开发与应用

摘要

栽培花生（Arachis hypogaea L.）在中国、印度、美国等广泛种植，是世界上重要的油料作物和经济作物。除了用于榨油外，花生也被用做鲜食或被加工成各种食品，花生在我国农民增收、农业结构调整中有着巨大的发展潜力和重要产业地位。目前，分子标记辅助选择(Marker assisted selection，MAS)已经成为作物育种的重要手段。分子标记辅助选择具有快速、准确且不受环境因素的干扰的优点，提升了育种的效率并缩短了育种周期。除了高油酸性状外，花生的其他性状鲜有分子标记辅助育种的报道。和水稻、玉米、小麦等粮食作物相比，花生的MAS 还处于起步阶段，其中，分子标记数量少是制约花生分子标记辅助选择发展的重要限制因素。本研究基于花生二倍体祖先种的全基因组测序的序列信息，开发了大量的花生基因组SSR标记，并将花生的SSR分子标记应用到花生杂交种F1真伪鉴定、抗叶斑病QTL分析等工作中，研究结果将为花生高密度遗传图谱构建、重要基因的定位、图位克隆及分子标记辅助选择育种奠定基础，主要研究结果如下： 1、花生全基因组SSR分子标记的开发 在花生野生祖先种全基因组测序的基础上，从花生祖先种Arachis duranensis和Arachis ipaensis中分别鉴定了135,529 和199,957个SSR位点，根据这些SSR位点的序列，设计引物，开发了总计 11.1 万个基因组 SSR 标记。在花生基因组中 SSR的密度很高，在 A. duranensis和A. ipaensis中平均每隔8 kb和6.7 kb就会有1个SSR标记。花生全基因组SSR标记以二个碱基和三个碱基重复为主，约占总SSR标记的84%；为了分析这些SSR在栽培花生中的扩增效率，我们利用电子PCR（In silico PCR）技术在花生栽培种Tifrunner的基因组中模拟扩增，结果显示8.6万（77%）个SSR能能够在栽培花生Tifrunner中得到有效的扩增。通过生物信息学分析和实际的扩增验证，我们发现这些SSR标记在花生祖先种A. duranensis、A. ipaensis和栽培种Tifrunner中具有很高的多态性，预示着这些SSR标记在花生分子育种中将具有很高的利用价值。 2、花生SSR标记在杂交种真伪鉴定中的应用 杂交育种是目前花生品种选育的主要方法。为了提高花生杂交育种的效率，对F1杂交种真伪性的鉴定非常有必要。为选育抗病、特色的花生新品种，我们分别将抗黄曲霉的“GT-C20”与感黄曲霉的“Tifrunner”进行正反杂交，抗青枯病的“J04”和感青枯病的“J62”进行正反杂交，“潍花10号”与黑种皮花生品种“豫花29”进行杂交，大花生品种“丰花1号”与野生资源“SAAS2015ID”进行杂交。利用本研究开发的SSR及过去报道的MITE 转座子标记完成了各杂交组合的杂交种 F1的真伪性检测。根据分子标记检测结果，从 254 个杂交 F1中总共鉴定出96个真的杂交种，真杂种率为37.79%。本研究证明SSR分子标记在花生杂交真伪检测中具有很高的应用价值，在播种前进行真杂种的鉴定，可为后续材料的种植节约时间和成本，为遗传群体构建、新品种选育等奠定基础。 3、构建了花生全基因组 SSR标记物理图谱，完成了对已有抗叶斑病 QTL位点的比较基因组学分析 根据SSR 标记在花生染色体上的物理位置，我们绘制了花生全基因组 SSR的物理图谱。我们将花生的全基因组 SSR 标记物理图谱与过去报道的部分 SSR 标记遗传图谱进行了比较分析。例如，我们对 A01 染色体的的物理图谱和 A01的遗传图谱进行了整合，34个标记（总标记的40.5%）能在物理图谱中找到对应的位置。物理图谱和遗传图谱的比较分析，将为遗传图谱的加密及QTL的精细定位奠定基础；另外，通过对A04染色体物理图谱和A04遗传图谱的整合，将花生抗叶斑病的两个QTL（qF2TSWV5和qF2LS6），定位在8.135 Mb的区间内，我们为该区间提供了719个基因组SSR标记。通过比较基因组学研究发现，在该区间内包含了 652 个基因，其中 49 个为抗病相关的基因，包括 2 个NB-ARC基因，3个LRR-receptor-like基因和3个WRKY基因，该结果将为候选基因的鉴定提供参考。 4、利用花生基因组SSR标记对花生野生和栽培种质资源进行遗传多样性分析 野生花生种质是花生遗传改良的重要资源，过去对野生花生的鉴定主要以表型鉴定为主。为了获得更准确的野生花生鉴定的方法，利用15对花生全基因组SSR标记，对9个花生野生近缘种和1个花生栽培种（Tifrunner）进行PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，有 14 对引物能在至少 7 个以上的花生材料中扩增出清晰、可辨识的条带，有效扩增比例为93.3%。我们还利用花生全基因组SSR标记对112份栽培花生的种质材料进行了遗传多样性分析，研究结果将为这些花生材料的进一步利用提供技术支撑。

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摘 要

Abstract

中英文缩略表

1 文献综述

1.1分子标记技术的发展

1.1.1 第一代分子标记

1.1.2 第二代分子标记

1.1.3 SSR分子标记原理

SSR分子标记在植物中的研究

SSR分子标记在植物中的应用

1.1.4 第三代分子标记

1.2花生分子标记的开发及应用

1.2.1 花生分子标记的开发

1.2.2 花生SSR标记的应用

1.2.3 本研究的内容和意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试花生材料

2.1.2 主要试剂盒和成品试剂

2.1.3 试剂配置

2.1.4 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 花生全基因SSR位点的鉴定的方法

2.2.2 花生全基因SSR引物的设计

2.2.3 电子PCR（In Silico PCR）方法

2.2.4 基因组DNA提取

3 结果与讨论

3.1 花生全基因组SSR的位点的鉴定

3.1.1 花生全基因组SSR位点的数量、种类和统计分析

3.1.2 花生全基因组SSR位点在花生不同染色体上的分布

3.2花生全基因组SSR标记的开发

3.2.1 花生全基因组SSR引物的设计

3.2.2 花生全基因组SSR引物的电子PCR分析

3.2.3 花生SSR引物在花生野生种和栽培种的实际扩增情况

3.3花生全基因组SSR标记的应用

3.3.1 花生SSR标记在花生野生种中的应用

3.3.2 利用分子标记进行花生杂交F1真伪鉴定

3.3.3 基因组SSR分子标记对花生种质资源进行鉴定

3.3.4 利用功能性和基因组SSR分子标记对花生栽培种质资源进行遗传多样性分析

3.3.5 花生SSR标记在花生QTL定位方面的应用

4 总结

5 参考文献

6 攻读学位期间发表的学术论著

7 致谢