“下丘脑-脑干-肠脑轴”中CRF在大鼠束缚—浸水应激中的作用

摘要

束缚-浸水应激模型（Restraint Water-Immersion Stress，RWIS）是一种快速对大鼠心理和生理造成伤害的刺激模型。在这种应激模型中，大鼠在短时间内因受到刺激，体温下降，胃肠功能紊乱，导致胃酸分泌增加和急性胃黏膜损伤。肠神经系统是位于胃肠道壁中的神经元、神经递质和肠细胞组成的网络，控制和调节胃肠道中的平滑肌，黏膜上皮和血管效应系统，它的调节具有高度的自主性，因此也被称为“肠脑”。经本实验室的早期研究发现，大鼠在一定的应激时间段内，随着束缚-浸水的时间增长，下丘脑的室旁核（hypothalamic paraventricular nucleus，PVN）、视上核（supraoptic nucleus，SON）、孤束核（Solitary Nucleus,NTS）、迷走神经背核（dorsal motor nucleus of the vagus，DMV）和肠道肌间神经丛中Fos和GFAP（Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP）的表达水平显著升高，我们推测束缚-浸水应激造成胃黏膜损伤不只是涉及到脑干内神经元的过度活动这种初级中枢机制[75]，所以我们提出了“下丘脑-脑干-肠脑轴”环路参与了对应激的调控。而促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropin-Releasing Factor，CRF）作为下丘脑的室旁核、视上核释放的非常重要的激素之一，已研究表明其参与了多种应激（热刺激、冷刺激、感染和毒物刺激）反应，但促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）及其受体是否参与了束缚-浸水应激尚未见报道。因此，我们提出以下几个问题： 1.CRF及其受体是否介导和参与了RWIS过程，并在RWIS中各时间段有何变化？ 2.侧脑室注射CRF受体阻断剂Astressin和CRF后，对孤束核及肠道内的神经元和胶质细胞有何影响？ 3.CRF若参与束缚-浸水的过程，是通过哪条信号路径起作用？为了解决上述问题，我们实验设计如下： 实验研究一：大鼠随机分为对照组（RWIS0h）和应激组（RWIS1h，RWIS2h，RWIS3h）后，采用免疫组化和免疫印迹法检测大鼠CRF及其受体表达的影响，以探讨CRF及其受体是否参与了RWIS过程。 实验研究二：将大鼠分为对照组（侧脑室注射生理盐水）、CRF组（侧脑室注射CRF）和Astressin组（侧脑室注射CRF-R抑制剂Astressin），大鼠束缚-浸水应激1h后，免疫组化和免疫印迹法检测NTS、DMV以及肠神经系统中Fos、GFAP、p-ERK1/2、NOS表达，探讨CRF在束缚浸水过程中的作用? 实验研究三：将大鼠分为对照组（侧脑室注射生理盐水）、CRF组（侧脑室注射CRF）和PD98059+CRF组（侧脑室注射p-ERK1/2特异性抑制剂PD98059和CRF），大鼠束缚-浸水应激1h后，免疫组化和免疫印迹法检测NTS和DMV内Fos和星形胶质细胞的标记物GFAP表达的变化，探究CRF参与束缚-浸水的信号途径? 实验研究四：将大鼠分为对照组（侧脑室注射生理盐水）、CRF组和Astressin组，大鼠束缚-浸水应激1h后，免疫组化和免疫印迹法检测肠神经系统中的Claudin-1、Occludin和胃黏膜中的MUC5AC表达变化，探究CRF对胃肠道功能的影响? 实验结果： 1.与对照组相比，实验组大鼠脑干迷走复合体内CRF-R1与肠神经系统内CRF的表达明显增加，且呈时间依赖性，在3h达到了最高。而与对照组相比，实验组大鼠迷走复合体内CRF-R2的表达明显降低，且呈时间依赖性，在3h达到了最低。表明肠神经系统内CRF及脑干（NTS、DMV）内CRF-R1被激活，参与了RWIS过程。 2.与侧脑室注射生理盐水对照组相比，侧脑室注射CRF-R抑制剂Astressin，束缚-浸水应激1h后，实验组NTS、DMV以及肠神经系统中的Fos表达、星形胶质细胞GFAP、p-ERK1/2、NOS表达都显著降低。而侧脑室注射CRF，束缚-浸水应激1h后，实验组NTS、DMV以及肠神经系统中的Fos表达、星形胶质细胞GFAP、p-ERK1/2、NOS表达都显著升高，表明促肾上腺激素释放激素可能激活了脑干和肠神经系统内一氧化氮能神经元参与了在束缚-浸水应激过程。 3.与侧脑室注射CRF对照组相比，侧脑室注射p-ERK1/2特异性抑制剂PD98059和CRF后，实验组NTS、DMV以及肠神经系统中的Fos和星形胶质细胞的标记物GFAP表达明显下降，表明CRF可能通过ERK1/2信号通路参与束缚-浸水过程。 4.与侧脑室注射生理盐水对照组相比，侧脑室注射CRF组肠神经系统中的Claudin-1、Occludin和胃黏膜中的MUC5AC表达显著降低。表明束缚-浸水对大鼠造成胃机能的损伤和机体内部发生了紊乱，而CRF在这个过程中可能加速了炎症反应和胃溃疡，而且这个过程主要是通过ERK1/2信号通路进行调控的。 实验结论如下： 1、脑干内的CRF受体CRF-R和结肠内的CRF都参与了束缚浸水应激的过程。 2、CRF主要是通过ERK1/2信号通路对束缚浸水后造成的胃肠机能紊乱进行调控的。

目录

声明

符号说明

综述:束缚-浸水应激的研究进展

1 束缚-浸水应激

1.1 关于应激

1.2 束缚-浸水应激模型

2 脑干与束缚-浸水应激

2.1 孤束核与束缚-浸水应激

2.2 迷走神经背核与束缚-浸水应激

3 肠神经系统

4 CRF及其受体

4.1 CRF及其受体的结构、分布与功能特征

4.2 CRF与应激调控的研究进展

4.3 CRF和HPA轴调控

5.1 MAPK信号通路

5.2 ERK家族成员

5.3 ERK1/2信号通路在应激反应中的调控

实验研究一：RWIS对脑干CRF受体的影响

前言

1 实验材料

1.1实验仪器

1.2实验试剂

1.3 实验动物

1.4 束缚-浸水应激模型的建立

2 实验方法

2.1 免疫组织化学

2.2 Western Blot实验方法

4. 实验结果

4.1 RWIS对脑干内CRF-R1表达的影响

4.2 RWIS对脑干内CRF-R2表达的影响

4.3 RWIS对结肠内CRF表达的影响

5 讨论

5.1 脑干（NTS、DMV）中CRF-R参与RWIS过程

5.2 结肠中CRF参与RWIS过程

前言

1 实验材料

1.1实验仪器

1.2实验药品

1.3 试剂配制

1.4 侧脑室注射埋管模型

2 实验方法

3 实验结果

3.1 侧脑室注射Astressin对Fos表达的影响

3.2 侧脑室注射Astressin对GFAP表达的影响

3.3 侧脑室注射Astressin对NOS表达的影响

3.4 侧脑室注射Astressin对p-ERK1/2表达的影响

3.5 侧脑室注射CRF对Fos表达的影响

3.6 侧脑室注射CRF对GFAP表达的影响

3.7 侧脑室注射CRF对NOS表达的影响

3.8 侧脑室注射CRF对p-ERK1/2表达的影响

4 讨论

实验研究三：CRF通过ERK1/2信号通路在RWIS中的作用

前言

1 实验材料

1.1 实验仪器

1.2 实验药品

1.3 试剂配制

1.4 实验动物

2 实验动物模型

2.1 侧脑室注射

2.2 大鼠束缚-浸水

3 实验方法

4 实验结果

4.1 侧脑室注射PD98059+CRF对脑干内Fos表达的影响

4.2 侧脑室注射PD98059+CRF对脑干内GFAP表达的影响

5 讨论

实验研究四：侧脑室注射抑制剂或CRF对胃肠功能的影响

前言

1 实验材料

1.1实验仪器

1.2实验药品

1.3 试剂配制

1.4 实验动物

2 实验取材

3 Western Blot实验方法

4.1实验步骤

4.2数据处理

5 实验结果

5.1 侧脑室注射CRF对肠道内Claudin-1表达的影响

5.2 侧脑室注射CRF对肠道内Occludin表达的影响

5.3 侧脑室注射Astressin或CRF后黏蛋白5AC(MUC5AC)的变化

6 讨论

参考文献

全文小结

致谢