黄瓜菌核病拮抗细菌的分离、鉴定及抑菌活性初步研究

摘要

本文旨在从日光温室蔬菜根际土壤中分离筛选对黄瓜菌核病等植物土传病害致病菌具有良好拮抗活性的生防细菌，考察其用于植物病害防治的潜力，并对其抑菌活性物质进行初步探讨。 利用平板稀释法和点接法相结合，对采自山东泰安、日照、淄博、济南、德州、聊城、寿光、潍坊、诸城等9个地市黄瓜日光温室的土壤样品进行拮抗细菌的分离和筛选，共获得21株对黄瓜菌核病菌具有拮抗活性的细菌，其分布率与田间发病率呈正相关。平板对峙法复筛发现，其中有4株细菌对黄瓜菌核病菌具有强拮抗作用，以．BSH-4抑制率最高为91.1％，抑菌带宽为18.5mm，继代培养10代的培养物抑菌率达到88.5％。各菌株在抑制病原菌菌丝生长时，均与病原菌之间形成明显的抑菌宽带，说明该拮抗菌对黄瓜菌核病菌的抑制机理主要为抗生物质的产生。 显微观察结果表明，4株生防细菌对黄瓜菌核病菌菌丝微观结构影响各不相同。其中，BMP-11处理使黄瓜菌核病菌菌丝变得粗大、弯曲，形成分隔，菌丝体内原生质聚集成块；BL02处理则使菌丝体变粗，体壁溶解，壁内原生质聚集、外溢，菌丝体逐渐变得稀薄透明；BSH-4处理病原菌菌丝扭曲变粗，菌丝体内原生质褐化、聚集，但无外溢现象；ZB13处理对菌核病菌菌丝的微观影响相对较弱，除菌丝变细、分枝增多外，无其他明显变化。 抑菌谱测定结果表明，4株拮抗细菌均具有广谱抑菌活性，其中BMP-11抑菌活性最高，对黄瓜猝倒病菌、蔓枯病菌、枯萎病菌、立枯病菌、番茄早疫病菌、辣椒疫病病菌、茄子绵疫病菌等7种病菌均具有强烈抑制作用，对除黄瓜猝倒病菌和辣椒疫病病菌以外的其他5种病菌的抑菌带宽度均在15mm以上，其次是BL02和BSH-4，对番茄早疫病菌的抑菌带宽度也在15mm以上，ZB13对7种病原菌也均有不同程度的抑制作用，但活性相对较弱。 采用生理生化特性分析和16SrDNA序列分析两种方法对4株生防菌进行鉴定。结果表明：BMP-11菌属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、BL02菌属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、BSH-4和ZB13菌等同属于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。 通过种子处理、离体叶片接种、温室盆栽试验和田间防效试验，以及常用杀菌剂对生防菌的抑制试验，初步研究了各生防菌的最佳应用途径及使用方法。结果表明上述拮抗菌株兼具防治植物病害和促进植物生长的潜能。利用发酵液混以载体涂抹在植物病部防治菌核病效果较佳。由于一般常用杀菌剂在田间用量下对各生防菌基本无影响，可以将生物菌剂与化学药剂同时使用，以取得更好的防治效果。 抑菌活性物质测定试验结果表明，BMP-11、BL02和BSH-4菌的非蛋白提取物和蛋白提取物均对黄瓜菌核菌有一定的抑制作用，ZB13菌以发酵培养中产生的抗菌蛋白来抑制黄瓜菌核菌的生长。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

1引言

1.1黄瓜菌核病研究进展

1.1.1黄瓜菌核病概述

1.1.2黄瓜菌核病防治现状

1.2拮抗细菌研究进展

1.2.1目前拮抗细菌应用的主要种类

1.2.2拮抗细菌的主要作用机制

1.2.3利用拮抗细菌在植物病害防治中的优势及主要应用途径

1.2.4细菌作为生防因子存在的问题及相关对策

1.3研究展望

2材料与方法

2.1材料

2.1.1拮抗细菌来源

2.1.2供试病原菌

2.1.3供试植物品种

2.1.4主要仪器及试剂

2.2方法

2.2.1拮抗细菌的分离筛选

2.2.2优良菌株鉴定(方中达，1998；东秀珠等，2001)

2.2.3防病促生试验

2.2.4杀菌剂对病原菌与拮抗菌的选择毒力

2.2.5拮抗提取物活性检测

3结果与分析

3.1拮抗细菌的室内筛选

3.1.1细菌分离条件优化

3.1.2病原菌与其拮抗细菌的消长关系

3.1.3强拮抗细菌单胞分离后代的抑菌活性测定与继代培养

3.1.4强拮抗菌对黄瓜猝倒病等7种常见蔬菜土传病原真菌的抑制作用

3.1.5拮抗菌对病原菌菌丝的微观影响

3.2菌种鉴定结果

3.2.1菌体形态

3.2.2培养性状

3.2.3生理生化特性

3.2.4 16SrDNA序列分析结果

3.3优良菌株的生防效果

3.3.1拮抗菌发酵液对黄瓜种子萌发的影响

3.3.2离体试验测定生防菌的保护作用

3.3.3盆栽防治试验结果

3.3.4田间防病试验

3.4杀菌剂对病原菌和生防菌的选择毒力

3.4.1杀真菌剂对病原菌与拮抗菌的抑制作用比较

3.4.2铜制剂对生防菌的毒力

3.4.3阳离子杀菌剂对生防菌的毒力

3.5抑菌活性物质初步研究

3.5.1高温高压灭活发酵液抑菌作用

3.5.2去菌体发酵液抑菌作用

3.5.3非蛋白提取物抑菌作用

3.5.4蛋白提取物抑菌作用

4讨论

4.1从土壤中筛选土传病害拮抗细菌的意义

4.2关于拮抗菌株鉴定

4.3生防菌防治黄瓜菌核病等土传病害的潜力

4.4关于生防菌应用途径的探讨

5结论

6本论文创新之处

参考文献

攻读学位期间发表论文

致谢