用核酸探针和分子斑点杂交技术检测家禽病毒的核酸

摘要

在鸡群中同一个体同时存在不同的病毒感染是普遍现象，因此如何能同时检测同一份病料中不同的病毒，对于疫病的鉴别诊断和流行病学研究甚为重要。本研究试图运用分子斑点杂交技术，同时用不同的病毒核酸探针检测同一批病料中的不同病毒，它们分别是禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性贫血病毒(CAV)、呼肠孤病毒(ARV)和传染性支气管炎病毒(IBV)。 本实验从泰安某市场采集地方品种鸡的脾脏200份、羽毛囊200份；从莱阳某商品肉鸡场采集脾脏200份、鸡胚100枚，共计700份样品。用REV LTR序列和pol基因标记的核酸探针、MDV PP38基因标记的核酸探针、CAV VP1基因标记的核酸探针、ARV 63基因标记的核酸探针、IBV N基因标记的核酸探针，分别检测REV、MDV、CAV、ARV和IBV。检测结果如下： 200份地方品种鸡脾脏样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的检测结果：MDV阳性123份， CAV阳性91份，ARV阳性21份，IBV阳性23份，用REV LTR序列标记的核酸探针检出REV阳性194份，用REVpol基因标记的核酸探针检出REV阳性10份。 200份地方品种鸡脾脏样品中MDV、CAV、ARV、mV和REV的共感染情况：MDV和REV共感染为7份，MDV和CAV共感染为60份，MDV和ARV共感染为17份，MDV和IBV共感染为10份，CAV和REV共感染为9份，CAV和ARV共感染为14份，CAV和IBV共感染为13份，MDV、CAV和REV的三重感染为6份，MDV、CAV和ARV的三重感染为13份，MDV、CAV和IBV的三重感染为7份(REV的感染数据来自pol基因标记的核酸探针检测结果)。 200份地方品种鸡羽毛囊样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的检测结果：CAV、ARV和IBV全部阴性，MDV阳性121份，用REV LTR序列和pol基因标记的核酸探针检测REV全部阴性。 200份商品肉鸡脾脏样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的检测结果：MDV阳性177份， CAV阳性143份， ARV和IBV全部阴性，用REV LTR序列标记的核酸探针检出REV阳性103份，用REV pol基因标记的核酸探针检测REV全部阴性。 200份商品肉鸡脾脏样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的共感染情况：MDV和CAV的共感染为137份(REV的感染数据来自pol基因标记的核酸探针检测结果)。 100份莱阳鸡胚样品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的检测结果：MDV、ARV和IBV全部阴性，CAV阳性100份，用REV LTR序列和00l基因标记的核酸探针检测REV全部阴性。 在对200份地方品种鸡和200份商品肉鸡的脾脏样品用REV LTR序列和pol基因标记的核酸探针同时检测REV时，两种核酸探针对REV的检出率差异极大：在200份地方品种鸡脾脏样品中，用REV LTR序列标记的核酸探针检出REV阳性194份，而用REV pol基因标记的核酸探针检出REV阳性仅为10份，并且这10份阳性样品包含在上面的194份阳性样品中；在200份商品肉鸡脾脏样品中，用REV LTR序列标记的核酸探针检出REV阳性103份，而用REV pol基因标记的核酸探针检测REV全部阴性。对比结果表明，用REV LTR序列标记的核酸探针，对REV的检测结果大部分是非特异性的，可能是由LTR序列整合到其它病毒或宿主基因组造成的REV假阳性，因此在应用分子斑点杂交技术检测REV时，不能选用REV LTR序列标记探针，而应选择REV的其它基因标记探针，如pol基因，这样很大程度上可以提高REV检测的特异性。 从莱阳某种鸡场送检的疑似鸡传染性贫血的病鸡骨髓、胸腺和法氏囊中提取组织DNA和RNA，斑点杂交检测REV、MDV、CAV、ARV和IBv。检测结果显示：CAV全部阳性，REV、MDV、ARV和IBV全部阴性。以CAV阳性组织DNA为模板，设计一对特异性引物，对病料中的CAV的VPl基因进行了克隆和序列测定。序列测定结果显示其VPl基因全长为1350bp，在与其它CAV参考株VPl基因比较后发现其与America株同源性最高(98.7％)。

目录

论文说明：英文缩略词

声明

前 言

1核酸探针的概念

2核酸探针的种类

3核酸探针的标记

4核酸探针的斑点杂交方法

实验一、REV、MDV、CAV、ARV和IBV核酸探针的标记和敏感性、特异性检测

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1 PCR和RT-PCR扩增结果

2.2 PCR和RT-PCR扩增产物的序列测定结果

2.3核酸探针的敏感性试验结果

2.4核酸探针的特异性试验结果

3 讨论

实验二、利用斑点杂交反应检测采集样品中的REV、MDV、CAV、ARV和IBV

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

3讨论

实验三CAV的斑点杂交检测及其VP1基因序列分析

1材料和方法

1.1病料的采集和处理

1.2应用斑点杂交反应检测REV、MDV、CAV、ARV和IBV

1.3病料中CAV VP1基因的克隆及序列测定

2结果

2.1病料的斑点杂交检测结果

2.2 PCR扩增结果

2.3重组质粒的酶切鉴定结果

2.4病料中CAV的VP1基因核苷酸序列

2.5病料中的CAV与其它CAV参考株VP1基因序列比较

2.6病料中的CAV与其它CAV参考株VP1基因推导氨基酸序列比较

3讨论

结论

附表1：病料中CAV VP1基因核苷酸序列

参考文献

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