鸡繁殖性状相关基因及卵巢组织差异表达基因研究

摘要

家禽的繁殖性状，包括开产日龄、产蛋数、蛋重等是现代家禽生产中重要的经济性状。研究家禽繁殖性状相关的基因对于揭示影响家禽产蛋性能的的遗传机制和优质高产蛋鸡的选育有重要的意义。候选基因法是一种定位数量性状基因的主要方法，这种方法是依据生物体内已知的或可能的生理生化过程来选择相关基因并对其与表型的关系进行探讨。利用候选基因鉴定法定位主效基因在畜禽中已有许多成功的范例，如鸡性连锁矮小基因，猪应激综合症基因等。差异显示RT-PCR是研究基因差异表达的重要方法。 本研究通过候选基因法分析了繁殖性状相关基因FSHR、．BMPR- IB多态性与鲁禽鸡群产蛋性能的关系，分析了FSHR、BAIPR-IB和IGFBP-4 mRNA在济宁百日鸡和罗曼褐卵巢和卵泡中的发育性变化；采用差异显示RT-PCR技术筛选并克隆了卵巢组织差异表达的几个基因。 试验一：克隆了济宁百日鸡、文昌鸡、仙居鸡、海蓝褐、藏鸡FSHR 5’调控区约1.8 kb的序列，GenBank登录号DQ303232～DQ3032327，检出核苷酸变异48处。其中39处单核苷酸置换，1处三核苷酸置换和8处插入/删除突变。-1046变异包含了A、G、T三个核苷酸，其余24个为转换突变，14个属于颠换突变。在-868位点存在一段200bp的插入序列，突变率极低，仅0.0698(鲁禽群体)。对鲁禽群体，PCR检测了．868位点的多态性分布；变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测了-71“TG”插入/删除突变；通过PCR-RFLP方法检测了-237T→A的突变。关联分析的结果表明，上述三个位点的多态性对鲁禽肉鸡33周(E33)和42周(E42)的产蛋数效应不显著。通过三位点的Hardy-Weinberg检验，证明群体处于平衡状态。比对-868插入序列发现其中有24 bp与人的SMARCALl基因(SWI/SNF related，matrix associated，actin dependent regulator ofchromatin，a-likel)同源，可能与染色质的状态调节有关。 试验二：克隆了济宁百日鸡、文昌鸡、仙居鸡、海蓝褐、藏鸡BMPR-IB外显子6～7序列，GenBank登录号NW_000203。检出11处单核苷酸变异，其中9个转换，2个颠换。PCR-SSCP和RFLP方法分别检测了鲁禽群体35C-T和287G→A两处突变。与产蛋性能E33和E42关联分析结果表明，这2个位点的效应亦不显著。Hardy-Weinberg检验35位点群体处于平衡状态，而287位点群体处在不平衡状态。 试验三：通过半定量RT-PCR分析了繁殖性状相关基因FSHR、BMPR-lB和IGFBP-4 mRNA在济宁百日鸡和罗曼褐卵巢和卵泡中的发育性变化。两品种两期卵巢、卵泡中FSHR mRNA的表达差异极显著；济宁百日鸡黄卵泡和F5卵泡中FSHR mRNA的表达差异显著高于F3卵泡，与卵巢的表达水平差异极显著。罗曼褐黄卵泡中FSHRmRNA的表达差异显著高于F5卵泡和F3卵泡，与卵巢的表达水平差异极显著。济宁百日鸡与罗曼褐相比，在15周卵巢和黄卵泡中BMPR- IB mRNA表达水平差异极显著。济宁百日鸡卵泡中IGFBP-4 mRNA表达显著低于卵巢；而罗曼褐IGFBP-4 mRNA的表达变化不显著。两品种各级卵泡间变化不显著。 试验四：通过差异显示RT-PCR得到鸡卵巢组织差异表达基因7个。TPD52L2在济宁百目鸡和罗曼褐20周龄(产蛋早期)较15周(未开产)卵巢中mRNA表达水平显著上调；DNAJC8mRNA表达水平在济宁百日鸡和罗曼褐20周龄较15周卵巢中下调，差异极显著；LDHB mRNA表达水平在罗曼褐15周龄到20周龄表达下调，而在济宁百日鸡无显著变化；其它TNRC6A表达上调，LOC771135、ChEST756m4、LOC772269表达下调，差异均达到显著水平。 家禽的性成熟由一系列基因形成的基因网络调控。本研究通过对．FSHR、BMPR-IB和IGFBP-4的序列分析、多态性检测和表达分析，探讨了它们与鸡产蛋性能的关系；通过对卵巢组织在性成熟过程中基因表达的变化，找到了7个差异表达的基因，为进一步深入分析鸡繁殖性能尤其是性早熟相关的基因，进而用于高产、优质鸡的分子育种奠定了基础。

目录

声明

摘要

文献综述

材料与方法

试验一鸡FSHR 5'调控区的克隆及其与产蛋性能的关系

1试验材料

2试验方法

3结果与分析

3.1鸡血中提取的基因组DNA

3.2鸡FSHR 5'调控区序列的克隆、测序

3.3 FSHR 5'调控区的序列分析

3.4 FSHR 5'调控区-71位点的多态性检测

3.5 FSHR 5'调控区-237位点的多态性检测

3.6 FSHR 5'调控区-868位点200 bp插入序列的多态性检测

3.7数据统计及遗传效应分析

4讨论

试验二鸡BMPR-IB外显子6-7序列的克隆及其遗传效应分析

1试验材料

2试验方法

3结果

3.1鸡血中提取的基因组DNA

3.2 BMPR-IB外显子6-7序列克隆测序

3.3 BMPR-IB 35位点多态性检测

3.4 BMPR-IB 287位点的PCR-RFLP检测

3.5数据统计和关联分析

4讨论

试验三鸡FSHR、BMPR-IB和IGFBP-4 mRNA在卵巢组织和卵泡的表达

1试验材料

2试验方法

3结果

3.1提取总RNA的检测

3.2不同周龄鸡FSHR mRNA在卵巢、卵泡的表达变化

3.3不同周龄鸡BMPR-IB mRNA在卵巢、卵泡的表达变化

3.4不同周龄鸡IGFBP-4 mRNA在卵巢、卵泡的表达变化

4讨论

试验四鸡卵巢组织不同时期差异表达基因的克隆

1试验材料

2试验方法

3结果

3.1提取总RNA的检测

3.2 DDRT-PCR

3.3差异表达片段的回收和二次扩增

3.4差异显示片段测序

3.5差异表达基因检索

3.6半定量RT-PCR验证差异表达基因

4讨论

结论

参考文献

附录

致谢