禽网状内皮组织增生病病毒与J-亚群白血病病毒的致病性及其疫苗研究

摘要

禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)和J-亚群白血病病毒(Avian leukosis virus sLlbgroup J，ALV-J)同属反转录病毒，都能够引起从亚临床感染到明显的生长迟缓、免疫抑制和肿瘤等不同的临床病理变化。为了深入了解这两种反转录病毒对我国养禽业的危害性，本研究首次提出并证实，REV和ALN-J感染对NDV和AIV疫苗免疫后的HI抗体反应的抑制程度作为可量化的客观指标，可成功地用来比较REV和ALN-J不同毒株的致病性程度。结果表明，REV的早期感染可持续性地抑制鸡对疫苗的抗体反应，REV和ALN-J共感染的协同作用更进一步强化这一免疫抑制作用，从而可能严重干扰鸡群中对H5．AIV和NDV灭活疫苗的免疫预防效果。流行病学调查表明，REV和ALV-J及其共感染在我国鸡群中已相当普遍。本研究还显示，REV活疫苗免疫种鸡可有效预防雏鸡REV感染及其造成的免疫抑制。 1 REV对雏鸡雏鸭的致病性及其影响因素的研究 2不同ALV-J毒株对1日龄SPF鸡的致病性比较无论是来自白羽肉鸡的AIN-J还是来自黄羽肉鸡的ALV-J，感染1日龄SPF鸡后，对生长性能和对NDV、AIV(H5-和H9-)灭活疫苗免疫后HI抗体反应均呈现为程度不同的抑制作用。随着日龄的增大，这种抑制作用也越来越轻。相对而言，ALV-J对1日龄SPF鸡的致病作用低于REV；而且，ALN-J的不同毒株间，对雏鸡的免疫抑制作用的强度差异很大。 3 REV与ALV-J共感染在致病性上的协同作用在1日龄SPF鸡和商品代肉鸡分别进行了REV与ALV-J的单一感染以及共感染试验。结果表明，两种病毒的共感染较单一感染造成的免疫抑制作用也更为严重。在1周龄接种灭活疫苗后6w，对NDV的HI抗体滴度，对照组为7.43±1.50(28)，ALV-J和REV单独感染组分别为6.88±2.56(24)和6.00±3.13(11)，而REV和ALV-J共感染组则仅为4.29±3.38(14)，显著低于单一感染组(p<0.01)。显然两种反转录病毒的共感染较单一感染加重了对感染鸡群的免疫抑制作用。在感染1日龄商品代肉鸡后，REV和ALV-J共感染还显著提高了继发性细菌感染的比率及由此引起的死亡率。 4中国黄羽肉鸡中REV和ALV-J感染状态的流行病学调查 4．1 REV和ALV-J在中国鸡群中的垂直感染及其共感染已相当普遍本研究进行的流行病学调查发现，REV和ALV-J不仅经常从呈现免疫抑制和肿瘤的病鸡病料中分离到，而且在种蛋中也有较高的检出率。从我国南方某些地方品系的黄羽肉种鸡场送检的四批种蛋经孵化后发现，REV的分离率分别是2/14、5/17、5/12和5/29；ALV-J的分离率分别为2/14、1/17、2/17和3/29。本研究还发现了REV和ALN-J的共同垂直感染，57个胚体中的3个同时分离出REv和ALV-J。 4．2 中国黄羽肉鸡群中REV分离株env基因遗传系谱比较从广东某些黄羽肉鸡群分离到8株REV，分别对其中G．D051029和GD06LG1株的囊膜糖蛋白基因(env)PCR产物进行了克隆与测序，并与国内外己发表的14个REV株env基因的核酸序列进行比较。结果显示，GD051029、GD06LG1株与国际参考株鸭源的SNV株同源性高达99.8％-99.9％，而与本实验室1999从我国其它鸡群分离到的HA9901株的同源性只有93.7％-93.8％。对6个广东株401bp env，基因片段和LTR核酸序列比较也表明与SNV株同源性最高。似乎Pnv基因的同源性程度与REv对宿主种属来源并并无密切关系。 4．3 中国地方品系三黄鸡感染ALV-J的流行病学调查流行病学研究表明，中国地方品系三黄鸡中ALV-J的感染已经非常普遍。不仅在肝脏、脾脏和肾脏中出现和白羽肉鸡一样的骨髓样细胞肿瘤，而且还在胸腺和法氏囊也出现了在白羽肉鸡中未曾报道过的典型的骨髓样细胞瘤。从这些黄羽肉鸡分离的6株ALV-J gp85和gp37基因序列与白羽肉鸡中广泛存在的ALV-J毒株的同源性很高。特别是2005年从南方黄羽肉鸡分离的GD0512株与2000年从中国北方白羽肉鸡中分离的HN0001株的gp85的同源性高达95.1％，gp37同源性高达99.5％。这表明，这些黄羽肉鸡中的ALV-J很可能来源于白羽肉鸡。 5 REV与ALN-J及MDV诱发肿瘤的病理学形态学比较现场病料中这三种病毒病诱发的肿瘤的病理形态学鉴别一直是一个令人困惑的问题。为此，分别用REV、ALV-J及MDV人工感染1日龄SPF鸡或商品代肉鸡诱发肿瘤，比较观察每种病毒诱发肿瘤的肉眼病变和病理组织学形态。观察表明，三种病毒均可在肝脏引起白色的增生性肿瘤，形状也都不规则。MDV既可在肝脏诱发形状规则、界限分明但数量有限的MD特征性的大块肿瘤，也可引起散在的绿豆大小的肿瘤结节和形状不规则的增生性肿瘤。REV多在肝脏引发形状不规则的增生性肿瘤，与后一类型MD肿瘤难以区别。ALN-J可引起肝脏弥漫性肿大，布满细小的白色肿瘤结节，显著不同于MDV和REV诱发的肝脏肿瘤。但有时也能诱发大量绿豆大小的散在性肿瘤，这时也难以与MD肿瘤区别。在病理组织观察中，ALN-J肿瘤细胞为细胞质中带有大量嗜酸性颗粒的骨髓样细胞瘤，具有特征性，易与REV和MDV诱发的肿瘤细胞区别。人工感染MDV或REV诱发的肿瘤中，通常都为淋巴细胞或单核细胞，单纯的HE染色的病理组织切片很难鉴别MDV或REV肿瘤。 6 REV弱毒疫苗的研制及其保护性免疫效果迄今为止，国内外尚没有用于预防的REV疫苗。为了预防和控制鸡群中的REV感染，本研究为开发REV弱毒疫苗进行了前期研究。结果表明，用细胞适应毒REV-C99-p30免疫开产前4w的种鸡，在2w内全部产生抗体，不仅对生产性能无不良影响也不产生垂直感染，经免疫的种鸡产出的后代雏鸡全部带有抗FueV母源抗体，并可维持7天以上。该母源抗体不仅可预防REV病毒血症，而且可保护商品代肉鸡免于REV攻毒弓l起的生长迟缓和免疫抑制作用。在1日龄接种REV后，1周龄时用三种灭活疫苗免疫后4w，有REV母源抗体组和无母源抗体组对NDV、H9-AIV和H5-AIV的血凝抑制(HI)抗体滴度分别是3.36±2.04 vs 1.58±1.69(P<0.01)，6.27±3.87 vs 0.71±1.60(p<0.01)和6.72±3.92 Vs 0.54±1.44(P<0.01)。

目录

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文献综述

1 REV研究进展

1.1病原学

1.2流行病学特点

1.3 REV的致病性研究

1.4 REV感染的鉴别诊断

1.5 REV感染的预防控制

2 ALV-J研究进展

2.1病原学

2.2流行病学特点

2.3 ALV-J的致病性研究

2.4 ALV-J的鉴别诊断

2.5 ALV-J的预防初探

3本研究的意义

第一章REV对雏鸡雏鸭的致病性及其影响因素的研究

(一)不同来源REV毒株对1日龄SPF鸡的致病性比较

1材料与方法

2结果

3讨论

(二)不同剂量REV-C99株感染1日龄SPF鸡对灭活疫苗免疫反应的抑制作用

1材料与方法

2结果

3讨论

(三)不同日龄SPF鸡感染REV对NDV与AIV灭活疫苗免疫反应抑制作用的比较

1材料与方法

2结果

3讨论

(四)REV感染对高致病性禽流感灭活疫苗保护性免疫的干扰作用

1材料与方法

2结果

3讨论

(五)不同来源REV对雏鸭的免疫抑制和致肿瘤作用

1材料与方法

2结果

3讨论

第二章不同来源的ALV-J感染对SPF鸡免疫反应的影响

1材料与方法

1.1病毒来源

1.2实验设计

1.3对NDV和AIV灭活疫苗的免疫和免疫反应的测定

1.4不同ALV-J毒株感染对体重的影响

2结果

2.1不同ALV-J毒株感染1日龄SPF鸡对生长性能的影响

2.2不同ALV-J毒株感染1日龄SPF鸡对NDV灭活疫苗免疫后抗体水平的影响

2.3不同ALV-J毒株感染1日龄SPF鸡对H5-AIV灭活疫苗免疫后抗体水平的影响

2.4不同ALV-J毒株感染1日龄SPF鸡对H9-AIV灭活疫苗免疫后抗体水平的影响

3讨论

第三章REV与ALV-J共感染在致病性上的协同作用

(一)REV与ALV-J共感染对1日龄SPF鸡致病性的协同作用

1材料与方法

2结果

3讨论

(二)REV与ALV-J共感染对商品代肉鸡致病性的协同作用

1材料与方法

2结果

3讨论

第四章REV与ALV-J的流行病学调查

(一)REV与ALV-J在中国鸡群中垂直感染及其共感染的普遍性

1材料与方法

2结果

3讨论

(二)中国黄羽肉鸡群中REV分离株env基因遗传系谱比较

1材料和方法

2结果

3讨论

(三)中国地方品系三黄鸡感染ALV-J的流行病学调查

1材料与方法

2结果

3讨论

第五章REV和ALV-J诱发肿瘤与马立克氏病肿瘤的病理形态学比较

1材料与方法

1.1 SPF鸡

1.2制作病理切片的实验材料

1.3病理组织切片的的制作

2结果与分析

2.1形态学观察

2.2病理切片的H·E染色结果

3讨论

第六章REV与ALV-J的预防控制

(一)REV弱毒疫苗的研制

1材料与方法

2结果

3讨论

(二)肉用型种鸡接种REV疫苗后母源抗体对雏鸡的保护性免疫作用

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

(三)蛋用型种鸡免疫REV疫苗后母源抗体对同源及异源REV诱发免疫抑制的预防作用

1材料与方法

2结果

3讨论

(四)ALV-J弱毒疫苗研制的可行性探讨

1材料与方法

2结果

3讨论

结论

创新之处

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表、录用(或起草)论文