嗜热子囊菌光孢变种热稳定超氧化物歧化酶的纯化及基因克隆和表达

摘要

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)(EC．1.15．1.1)系一类金属酶，广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子(O<,2>)发生歧化反应，从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中，发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅基的不同，超氧化物歧化酶主要可分为Cu，Zn-SOD(存在于真核生物)，Mn-SOD(存在于原核生物和真核生物)，Fe-SOD(存在于原核生物和高等植物的叶绿体中)等类型。Mn-SOD和Fe-SOD的氨基酸组成相似，可能起源于同一祖先。 嗜热真菌产生的超氧化物歧化酶在高温条件下具有高活力和稳定性，并且与中温真菌一样，嗜热真菌产生的超氧化物歧化酶普遍含有多种类型的组分。嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus vat．levisporus)是一种广泛分布的，生长上限温度较高的嗜热真菌，能够在45℃～50℃的高温下很好的繁殖生长，而绝大多数的真核生物若长期暴露于40℃以上将无法存活。本研究中T. auranttiacus vat．levisporus在含干酪素的培养基中培养产生超氧化物歧化酶，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、．Phenvl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的Cu，Zn-SOD。分别用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法和Sephacrvl S-100凝胶过滤层析的方法，测定出本研究所获得的超氧化物歧化酶的分子量分别为16.8kDa和33.2kDa。证明在本研究中所得到的超氧化物歧化酶是一种由相同的2个亚基所构成的蛋白质，同时对该酶进行理化性质的研究。 T. aurantiacus var.levisporus Cu，Zn-SOD的N-端7个氨基酸序列为VKAVAVL，与其它己报道的Claviceps purpurea，Paecilomvces sinensis andGlomerella cinfzulata的Cu，Zn-SOD N-端氨基酸序列同源性较高，推测可能是一种新的Cu，zn-SOD。 根据T. aurantiacus var．levisporus Cu-Zn．SOD的N-端氨基酸序列和同源保守序列设计简并引物，通过RT-PCR．及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法，克隆了该Cu，Zn-SOD的编码基因，其全长cDNA为705bp，包含一个由155个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在GenBank中注册，登录号为D0497636。 由核苷酸序列推导的相应N端氨基酸序列与测定的纯酶N端序列完全一致，成熟肽大小预测为16 kDa。 将经EcoR I和Not I双酶切的Cu，Zn-SOD基因和原核表达载体pET-22b(+)进行连接，构建成原核表达载体pET/czsod，并转化大肠杆菌E coli BL21。经IPTG诱导培养4～5h，目的蛋白得到大量表达，SDS-PAGE电泳检测，在约17 kDa处有一条明显的蛋白带，蛋白大小与从该SOD氨基酸序列估计的蛋白分子量相符；而空质粒pET-22b(+)转化BL21经诱导培养后无相应蛋白产生，可溶性分析结果显示，表达的蛋白以包涵体形式存在。 同时根据真菌Mn-SOD同源保守序列设计简并引物，分析比较筛选设计简并引物，通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法，克隆了该。Mn-SOD的编码基因，其全长cDNA为878bp，包含一个由231个氨基酸组成的开放阅读框。该基因己在GenBank中注册，登录号为EF428323。

目录

声明

第一章文献综述

第二章嗜热子囊菌光孢变种热稳定Cu，Zn-SOD的分离纯化与性质研究

1.材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2.结果与分析

2.1不同培养时间对超氧化物歧化酶活性的影响

2.2最佳盐析条件的确定

2.3酶的分离纯化

2.4SOD的特性研究

2.5N-端氨基酸序列测定

3.讨论

3.1关于研究结果

3.2关于研究方法

3.3今后还应开展的工作

第三章嗜热子囊菌光孢变种Cu，Zn-SOD基因的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

1.材料和方法

1.1材料

1.2实验方法

2.结果与分析

2.1 T.aurantiacus var.levisporus总RNA的提取

2.2 Cu，Zn-SOD基因的分离

2.3 Cu，Zn-SOD基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.4 Cu，Zn-SOD成熟肽基因序列的分离

2.5 Cu，Zn-SOD基因在大肠杆菌中的表达

3讨论

3.1嗜热子囊菌光孢变种总RNA的提取

3.2构建表达载体时需要注意的问题

3.3外源基因在大肠杆菌中的表达

第四章嗜热子囊菌光孢变种Mn-SOD基因的cDNA克隆及序列分析

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2.结果与分析

2.1 Mn-SOD基因的分离

2.2 Mn-SOD基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.讨论

第五章结论和建议

1.结论

2.建议

参考文献

致谢

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