辣椒疫霉菌4个果胶甲基酯酶基因的克隆和pcpme6的真核表达研究

摘要

辣椒疫病在世界范围内广泛发生的土传病害,严重影响世界各国的农业生产,造成巨大的经济损失,病原是辣椒疫霉菌(Phtophthoracapsici)。辣椒疫霉菌是一种土传卵菌,以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬,可以存活数月甚至更长时间,在适宜条件下引起青椒茎腐、根腐和枯萎；寄主范围广,除侵染辣椒外,还可以侵染西葫芦、黄瓜、番茄等20多种作物。 目前,对于辣椒疫病的防治主要采用化学防治,而培育抗病品种效果不稳定,原因之一是辣椒疫霉具有较强的变异能力。因此,探索辣椒疫霉菌重要的致病因子,研究抗病性生理生化机制,结合抗病性遗传,抗病基因的QTL定位(quantitative trait loci)与基因工程,进行抗病性鉴定和抗病育种方面研究成为病害防治的前景。其中细胞壁降解酶在病害致病关键因子之一,包括角质酶(cutinase),果胶酶(pectinase),纤维素酶(cellulase),半纤维素酶(hemicellulase),蛋白酶(protease)等。而果胶酶又包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果胶甲基酯酶(PME),果胶裂解酶(PL)。果胶甲基酯酶(PME)是许多植物病原菌分泌的一种果胶酶,能降解植物细胞壁,许多病原真菌,卵菌,细菌在侵染过程都能分泌果胶甲基酯酶。本文以辣椒疫霉菌为研究对象,克隆辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因及表达研究。 以辣椒疫霉强致病和果胶甲基酯酶活性高的菌株为实验材料构建的DNA文库,借助Pool-PCR技术分离了4个果胶甲基酯酶基因。对基因结构分析发现4个pme基因具有很高的同源性,并具有不同数目的糖基化位点。所编码的蛋白具果胶甲基酯酶的保守序列和蛋白活性位点。本研究发现,辣椒疫霉pme基因与卵菌pme基因具高度保守序列,也证明了卵菌在自然界中的分类地位。并且对其中一个基因构建质粒进行体外诱导表达,制备了多克隆抗体,借助蛋白印记杂交验证了重组蛋白的免疫活性,其具体研究结果如下： 1、Pool-PCR法筛选基因文库,分离了4个果胶甲基酯酶基因 从GenBank中下载若干pme基因,同源比对设计多对引物(P230+AP650,P230+P920,P230+P795,P445+P920,P445+AP650,P620+P920,P650+P920,P445+P795),然后进行反复筛选,分离了3个全长和1个非全长基因。利用引物P230+AP650筛选出pcpme6,P650+P920筛选出pcpme7和pcpme8,其中P445+P920和P445+P795均能扩增出pcpme9。将所克隆的4个基因经过blast,显示全部为果胶甲基酯酶基因。经过DNAman软件处理分析了这4个基因的基本结构,最大开放阅读框长度差别不大,均在1100bp左右,编码345-348个氨基酸,预测氨基酸分子量为37-38kDa。利用http://www.expasy.org和http://www.cbs.dfu.dk/service/signalP对这四个基因的信号肽和N糖基化位点进行预测,信号肽长度16-20个氨基酸不等,N-端糖基化位点4-7个不等,4个基因的理论PI值为5-9。 2、RACE技术扩增pcpme9的3'端 将辣椒疫霉菌置于三角瓶进行振荡培养7天后,收集菌丝。然后液氮研磨,利用Trizol法提取总RNA,经反转录酶作用,合成cDNA,作为模板,以通用引物(USP)和基因特异引物(GSP)进行第一轮PCR;以第一轮产物做模板,用巢式特异引物(NGSP)和巢式通用引物(NUSP)进行第二轮PCR,目的片段回收,连接,转化大肠杆菌DH-5α后,送样测序。将测序片段拼接后,对其进行了初步分析,果胶甲基酯酶基因pcpme9序列全长为1041 bp,最大开放阅读框ORF为1038bp(1-1038),ORF编码一个346个氨基酸的蛋白质,预测编码产物大小约为38kDa,并有7个N糖基化位点,信号肽含16个氨基酸。 3、pcpme6真核表达和Western blot 根据已经克隆的pcpme6基因序列,设计特异性引物,PCR扩增其成熟肽片断。重组至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K/pcpme6,转化至大肠杆菌JM109中,筛选得到阳性克隆。重组质粒经stu I线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到数株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析发现,重组蛋白进行了特异表达,分子量大小为50KDa左右。通过将酵母分泌的PME蛋白免疫家兔,制备特异性抗体。Western blot分析结果进一步表明,转基因酵母成功表达,重组抗原有良好的免疫活性,多克隆抗体具有较高特异性和灵敏度,重组蛋白与制备的抗体特异性结合。

目录

论文说明:英文缩略表

声明

摘要

文献综述

引言

1辣椒疫病的研究进展

1.1辣椒疫病的危害

1.2传播途径及发病规律

1.3生理生化形状

1.4辣椒疫霉病害防治

2植物真菌致病基因的研究进展

2.1与侵染结构产生有关的基因

2.2与细胞壁降解有关的基因

2.3与寄主反应代谢物有关的基因

2.4毒素基因

2.5与信号传导有关的基因

3果胶甲基酯酶研究进展

3.1果胶

3.2果胶酶

4果胶酶的应用性研究

4.1利用果胶酶瓦解植物细胞的细胞壁

4.2部分分解细胞间质中的果胶物质

4.3利用果胶酶生产果胶低聚糖

5果胶甲基酯酶

5.1果胶甲基酯酶的存在与来源

5.2果胶甲基酯酶的分子量及分子组成

5.3果胶甲基酯酶的结构

5.4果胶甲基酯酶的性质与作用机理

5.5果胶甲基酯酶分子生物学研究

6利用酵母体系表达外源蛋白的研究进展

6.1毕赤酵母表达体系

6.2巴斯德毕赤酵母的生物学特性

6.3毕赤酵母宿主菌和表达载体的类型

6.4表达载体在毕赤酵母中的整合

7实验目的及意义

第一章果胶甲基酯酶基因克隆与测序

1.材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶pcpme6基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.2辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶基因pcpme7的核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.3辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶pcpeme8基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.4辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶pcpme9基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.讨论

3.1 PCR常见问题及解决方案

3.2利用基因组文库筛选基因

3.3果胶甲基酯酶基因的结构分析

第二章Race分离果胶甲基酯酶基因pcpme9 3’端

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 RNA的提取

2.2 RACE PCR结果

2.3测序结果

3讨论

3.1总RNA的提取

3.2 RACE技术

第三章辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶pcpme6的真核表达和western blot

1材料和方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 pcpme6成熟肽基因序列的分离

2.2酵母表达载体的构建和鉴定

2.3酵母转化子筛选与鉴定

2.4重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

2.5 western blot杂交

3.讨论

3.1表达系统的选择

3.2外源基因在Pichia pastoris中的分泌表达的必要性

3.3影响外源基因表达量的因素

3.4表达果胶甲基酯酶PME6的活性

3.5 western blot

结论与建议

1.结论

2.建议

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况