几丁质酶和群体感应信号在Serratia plymuthica生防活性中的作用

摘要

Serratia plymuthica HRO-C48分离自油菜根际,是一株产吲哚乙酸的植物根际促生细菌,主要通过产几丁质酶、蛋白酶和抗生素硝吡咯菌素等抗真菌因子抑制植物病原真菌。本研究运用转座子插入突变的策略,通过突变分析,在离体和温室条件下,研究了几丁质酶和群体感应信号在菌株HRO-C48生物防治中的作用；以HRO-C48基因组DNA为模板,克隆并在大肠杆菌E.coli中异源表达了第二个群体感应(Quornm sensing,QS)系统luxI/R同源物基因sprR/I。主要研究结果如下： 1.运用miniTn5转座子插入随机突变的方法构建突变体库,通过几丁质酶固体培养基检测,筛选出HRO-C48的几丁质酶缺失的突变株(chit)：通过报告菌株Chromobacterium violaceum CV026平板划线检测,筛选出HRO-C48的信号分子缺失的突变株(AHL-4);通过克隆信号分子合成酶基因splIR(GenBank accession no.AY841161)和引入重组质粒构建了互补菌株(AHL-4/splIR),并经酶切反应、PCR和测序进行鉴定。 2.采用平板对峙法测定了生防菌S. plymuthica HRO-C48及其衍生菌株对常见植物病原菌的抑菌活性。试验结果表明,HRO-C48对灰葡萄孢Botrytis cinema和瓜果腐霉Pythium aphanidermatum的菌丝生长有明显的抑制作用,相比之下,突变株AHL-4的抑菌作用减弱,而AHL-4/splIR的抑菌活性又回到野生菌株的水平；chit与HRO-C48的抑菌作用无明显差别。说明QS信号调控HRO-C48的抑菌活性,且在HRO-C48的拮抗作用过程中,抗生素处于重要地位。 3.用细菌悬浮液对番茄和菜豆进行浸种和灌根处理,测定生防菌及其衍生菌株诱导番茄和菜豆对灰霉病的抗病性。结果表明,无论是番茄还是菜豆,与野生菌HRO-C48相比,突变株AHL-4的诱导抗病性水平明显降低,说明QS信号正向控制寄主植物对灰霉病的诱导系统抗性；而通过比较野生菌HRO-C48与突变株chit的诱导抗性效果,我们可以看出,几丁质酶作为HRO-C48的诱导因子在番茄中比在菜豆中表现明显。 4.将细菌悬浮液对黄瓜进行浸种和灌根处理,在温室中测定对黄瓜苗期猝倒病的直接防治作用。病害调查结果表明,与自来水处理作对照相比,HRO-C48对黄瓜苗期猝倒病的防治效果达50-24％,QS信号突变株AHL-4的防治效果明显降低,仅为27-64％,表明QS信号影响HRO-C48对瓜果腐霉引起的黄瓜苗期猝倒病的防治效果；而几丁质酶突变株chit的防治效果为37.30％,介于菌株AHL-4与HRO-C48之间,说明在HRO-C48对黄瓜苗期猝倒病的防治过程中,除了直接的抑菌作用外,可能还包括几丁质酶对黄瓜的诱导抗病性作用。 5.用野生菌株HRO-C48和不同突变株预先对番茄进行浸种和灌根处理,随后在番茄叶片挑战接种灰霉菌,均能不同程度诱导番茄叶片内寄主防御酶PAL、POD和PPO活性的增强及酚类物质的积累。试验结果表明,无论是防御酶活性,还是酚类物质含量,用生防菌处理后再接种灰霉菌的番茄比单独接种生防菌的番茄要高；而在各处理中,HRO-C4S明显高于AHL-4,AHL-4/splIR恢复到野生菌水平,几丁质酶缺失突变株chit与HRO-C48相近,但也有差别,而自来水作对照处理的番茄活性最低。说明挑战接种灰霉菌有效激发了番茄体内寄主防御酶的活性及总酚含量的积累,并与番茄对灰霉病的抗性增加趋势存在显著的正相关。 6.根据亲缘关系相近的细菌属的LuxIR同源物序列比对,设计保守性引物,以HRO-C48的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将回收的PCR产物连接pMD19-T载体并转化到E.coil JM 109感受态细胞,获得阳性克隆,测序并在大肠杆菌中成功异源表达。利用生物信息学软件进行相似性序列比对和系统进化分析,结果表明,S.plymuthica HRO-C48的sprRI基因与S. proteomaculans 568的luxRI基因、S.marcescens strain 12的smaIR基因有较高的相似性。

目录

论文说明：英文缩略及中文对照表

声明

1前言

1.1植物根际促生细菌

1.1.1定殖

1.1.2促生作用

1.1.3嗜铁素的作用

1.1.4抗生作用

1.1.5溶菌作用

1.1.6诱导抗性

1.2常见的蔬菜苗期病害

1.2.1苗期猝倒病

1.2.2灰霉病

1.3 Quorum-sensing调控系统

1.3.1 Quorum-sensing系统的发现

1.3.2革兰氏阴性菌的LuxI-LuxR型群体效应

1.3.3革兰氏阳性菌中由寡肽介导的群体效应

1.3.4细菌群体感应系统的信号分子及其生物合成

1.3.5研究群体感应的手段和方法

1.3.6群体感应的生物功能及植物感知细菌QS信号分子启动应激反应

1.3.7转座子标签法在构建G细菌突变体库中的应用

1.4研究内容和意义

2 Serratia plymuthica HRO-C48几丁质酶和QS信号在植病生防中的作用

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2结果与分析

2.2.1生防菌抗真菌活性的室内测定

2.2.2诱导番茄对灰霉病的抗性

2.2.3诱导菜豆对灰霉病的抗性

2.2.4防治黄瓜苗期猝倒病

2.2.5防御酶活性和酚类物质的测定

3 Serratia plymuthica HRO-C48 sprRI基因的克隆与序列分析

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1 IPTG诱导QS信号及CV026平板检测

3.2.2重组质粒的PCR鉴定结果

3.2.3S.plymuthica HRO-C48 SprRI的生物信息学分析

4结论

5讨论

5.1生防菌抗真菌活性的室内测定

5.2诱导番茄和菜豆对灰霉病的抗性

5.3防治黄瓜苗期猝倒病

5.4防御酶活性和酚类物质的测定

5.5 Serratiap plymuthica HRO-C48第二个QS调控系统的鉴定

参考文献

致谢

研究生期间发表论文