长柄链格孢（Alternaria longipes）蛋白激酶基因克隆及功能研究

摘要

信号转导是外界同生物体或生物体细胞间的信息传递的重要手段。大量研究表明蛋白的可逆磷酸化是细胞信号传递系统的重要组成部分,也是生物体内存在的一种最为普遍的调节方式,在许多生命活动中扮演重要角色,几乎涉及所有的生理及病理过程。蛋白质可逆磷酸化是由蛋白激酶(protein kinase,PK)和蛋白磷酸酶(protein phosphates,PP)催化完成。蛋白激酶作为重要的信号分子逐渐被广大学者所认识和接受。 本研究以长柄链格孢(Alternaria longipes)为研究对象,研究了A longipes原生质体制备和再生的最佳方法和条件,采用10mg/mL的溶壁酶,选择菌龄为24h的菌体,酶解温度为30℃,酶解时间为3h,制备选择0.7M的NaCl,再生选择0.7M的蔗糖为稳渗剂,可以得到高浓度且再生能力强的原生质体。 利用限制性内切酶介导的整合技术成功的转化了A.longipes原生质体,并对转化体系进行了优化,包括限制性内切酶的种类和使用量、原生质体的浓度、质粒的形态和用量、PEG的浓度。本实验中用2 μg HindⅢ线性化的质粒pUCATPH,转化过程中加入20U限制性内切酶HindⅢ,原生质体浓度为107个/mL,60％的PEG3350,共获得600多个转化子,转接5代能稳定遗传。随机挑选转化子进行PCR验证,结果证明潮霉素基因已经整合到受体菌的基因组中。 研究并优化了农杆菌介导的A.longipes分生孢子转化,包括AS的使用状态和使用浓度、共培养时间、受体菌孢子浓度、农杆菌浓度。在诱导过程和共培养过程中加200μmol/LAS处理,共培养48h,农杆菌OD600为0.25,受体孢子浓度为106个/mL时,共得到了85个转化子,转化效率明显低于REMI。 利用蛋白激酶同源保守序列设计兼并寡核苷酸引物,结合RT-PCR和RACE技术从A. longipes中克隆得到了一种蛋白激酶,全长cDNA1905bp,包含有一个1476bp的开放阅读框,编码491个氨基酸残基。该基因的cDNA和DNA序列已经在GenBank中注册,登录号分别为EU381116和EU3811167。运用生物信息学软件对A. longipes蛋白激酶编码基因进行碱基组成和氨基酸组成特征、功能位点、跨膜结构、保守区结构以及一级,二级结构等方面进行了分析,并与其他来源的蛋白激酶编码基因进行了同源比较。aapkl基因的催化域具有蛋白激酶催化域一般结构的特征。亚区I的富含甘氨酸的区域(GTGSFGRV),亚区Ⅱ的K72和亚区Ⅲ的E91的保守碱基,亚区VIB的YRDLKPEN,亚区Ⅶ的DFG,亚区Ⅷ的GTPDYLAPE,亚区Ⅸ的D220,亚区Ⅺ的R280都是蛋白激酶中高度保守的碱基,并且在催化蛋白质的磷酸化过程中扮演着重要的角色。 采用同源重组利用双连接PCR(double-joint PCR)构建了aapk1 基因的打靶载体,分别取基因上游652bp和下游620bp片段作为同源重组的两臂。对A.longipes原生质体进行了转化,采用PCR方法筛选到aapkl基因缺失突变体,并利用southern杂交和RT-PCR的方法对筛选的转化子Δaapkl进行了验证,结果表明我们筛选的转化子就是aapkl基因缺失突变体。对ΔSaapkl转化子和野生菌进行了比较,结果显示Δaapkl转化子的产孢量和孢子的形状、大小、颜色都没有明显的差异,但△aapkl转化子在PDA上生长速度明显慢,PDB培养后测干重Δaapkl转化子也低于野生菌,我们认为aapkl基因对于A.longipes的菌丝生长起着调控作用。对致病性的研究结果显示,Δaapkl转化子孢子悬浮液接种NC89烟草的离体叶片,病斑出现晚,但病斑大小没有明显的差异。

目录

论文说明：英文缩略词及中文对照表

声明

第一章文献综述

1蛋白激酶研究综述

1.1蛋白激酶研究概述

1.2几种重要蛋白激酶研究概述

2丝状真菌的遗传转化研究综述

2.1原生质体-PEG转化

2.2电激转化法

2.3转座子介导的转化

2.4醋酸锂转化法

2.5限制性内切酶介导的整合转化

2.6农杆菌介导的遗传转化

3选题的目的、研究内容和技术路线

第二章长柄链格孢(A.longipeses)遗传转化系统的建立

第一节长柄链格孢原生质体的制备与再生

1材料与方法

2结果

3讨论

第二节长柄链格孢菌的限制性内切酶介导整合转化

1材料与方法

2结果

3讨论

第三节根癌农杆菌介导的长柄链格孢(A.LONGIPES)转化

1材料和方法

2结果与分析

3讨 论

第三章长柄链格孢(A.longipes)蛋白激酶基因的克隆及序列分析

1材料和方法

1.1材料

1.2长柄链格孢(A.longipes)蛋白激酶基因eDNA克隆

2结果

2.1 A.longipes蛋白激酶基因中间片段的分离

2.2 A.longipes蛋白激酶基因(aapkl)cDNA3'-末端的分离

2.3 A.longipes蛋白激酶基因(aapkl)eDNA 5'-末端的分离及序列分析

2.4 A.longipes蛋白激酶基因(aapk2)3'和5'末端的分离及序列分析

2.5 A.longipes蛋白激酶基因(aapkl)cDNA和DNA全长序列的扩增

2.5蛋白激酶aapkl的核苷酸和氨基酸序列分析

3讨论

3.1 Alternaria longipes蛋白激酶基因cDNA和DNA的获得

3.2基因分离技术

第四章长柄链格孢(A.longipes)蛋白激酶基因的功能研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1基因组DNA的提取

2.2质粒pUCATPH的提取

2.3打靶载体的构建

2.4 △aapkl转化子的筛选

2.5 △aapkl转化子的southern杂交

2.6.△aapkl转化子的RT-PCR

2.7 △aapkl转化子生物学性状和致病性分析

3讨论

3.1关于载体构建

3.2同源重组效率的影响因素

第五章结论与建议

1结论

2建议

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文的情况