Roscovitine（ROS）、亚胺环已酮（Cycloheximide，CHX）和培养温度对山羊卵母细胞减数分裂恢复的调控

摘要

体外成熟卵母细胞的发育能力还远不如体内成熟卵母细胞。卵母细胞只有细胞核和细胞质二者都成熟后,才能支持胚胎发育。在体内,卵泡液中的生发泡破裂(GVBD)抑制因子控制卵母细胞不过早自发恢复减数分裂,而使卵母细胞经历一个相当长的转录和转录后翻译过程来逐步获得胞质成熟。而在体外,由于脱离了卵泡液的抑制环境,卵母细胞提前自发恢复核分裂,细胞质没有充分的时间成熟,因而影响了发育能力。为了改善卵母细胞体外胞质成熟质量,人们采用“两步法”培养卵母细胞,即先用药物抑制卵母细胞的GVBD,延长卵母细胞处于生发泡期的时间,使卵母细胞有充分的时间合成某些必要的物质；然后,再正常培养,改善卵母细胞的发育潜力。但是,目前大多数的研究都没有提高卵母细胞的发育能力,主要原因之一是抑制卵母细胞GVBD的药物因有毒性而剂量难以掌握。因此,该方法还需要进一步的改善。细胞在低温下其代谢会减慢。因此,本研究假设,低温培养能够抑制卵母细胞减数分裂恢复,或者至少能减少所需抑制药物的剂量。之前的研究证明,高浓度的ROS能抑制山羊卵母细胞发生GVBD,但长时间高浓度抑制损伤卵母细胞的发育能力。因此,本研究用低温和ROS联合控制山羊卵母细胞减数分裂恢复,希望降低ROS浓度,提高卵母细胞发育能力。亚胺环己酮(Cycloheximide,CHX)也是一种较为理想的抑制药物。然而,CHX在山羊上的研究很少,对于CHX抑制后山羊卵母细胞的成熟、发育和胞质成熟都没有研究报道。本研究把山羊卵母细胞在不同培养温度下联合不同浓度ROS、或者单独用不同浓度CHX抑制培养,抑制后卵母细胞或者转为正常培养或者进行光镜/共聚焦显微镜观察。成熟的卵母细胞或者进行化学激活、体外受精来研究胚胎发育,或者进行光镜/共聚焦显微镜观察。研究结果表明： 1、5℃低温可以抑制山羊卵母细胞减数分裂恢复,添加了25mM Hepes的M199(H-M199)抑制24h后转为正常培养不影响随后卵母细胞的成熟。M2、mPBS抑制后转为正常培养卵母细胞成熟能力显著下降。但是,低温下不同液体对卵母细胞生发泡染色质构型没有影响。 2、5℃不添加ROS、20℃添加50μM ROS、38.5℃添加200μM ROS能有效抑制山羊卵母细胞减数分裂恢复24h,并且转为正常培养后不影响卵母细胞的成熟和孤雌激活能力。 3、抑制后再成熟的卵母细胞经过化学激活,胚胎培养,5℃不添加ROS组(5C)、20℃添加50μM ROS组(20C)、38.5℃添加200μM ROS抑制8h组(8 hr)的卵母细胞发育到桑椹胚/囊胚比例与对照组相似,但是38.5℃添加200μM ROS抑制24h组(24 hr)的卵母细胞发育能力显著下降,没有囊胚产生。 4、抑制后再成熟的卵母细胞体外受精后,5C组、20C组卵母细胞发育到桑椹胚/囊胚的比例与对照相似,在8 hr组中由于高的多精受精率导致卵母细胞发育到桑椹胚/囊胚的比例很低。 5、5C组卵母细胞抑制过程中GV染色质构型没有发生变化,转为正常培养后生发泡破裂的时间没有加快。但是20C组和8 hr组卵母细胞内生发泡染色质构型变化显著,核仁减小,导致转为正常培养后GVBD加快。 6、抑制过程中卵母细胞的皮质颗粒发生迁移,微管凝集形成微管组织中心,并且随着ROS浓度的下降越明显。再成熟后,5C组、20C组中皮质颗粒完全迁移的卵母细胞比例显著高于8 hr组。说明降低ROS的作用浓度对于胞质成熟更有利。 7、1μg/ml CHX能够有效抑制山羊卵母细胞减数分裂恢复24h。抑制24h转为正常培养24h,不影响卵母细胞的成熟和孤雌激活能力,并且CHX抑制后再成熟的卵母细胞经孤雌激活发育到囊胚的比例与对照组卵母细胞相似。 8、体外受精后,CHX抑制后再成熟卵母细胞的多精受精现象显著增加,发育到桑椹胚/囊胚的比例显著低于对照组。 9、CHX抑制过程中皮质颗粒仍能发生迁移,但是CHX抑制会对皮质颗粒的迁移造成不可恢复的损伤,使再成熟的卵母细胞内皮质颗粒不能完全迁移。 10、CHX抑制对山羊卵母细胞α-微管和微丝都没有影响,无论是抑制后处于生发泡期的卵母细胞,还是抑制后再成熟的卵母细胞,微管和微丝的分布都与对照卵母细胞相似。 总之,山羊卵母细胞能够忍受低温,无论是对于核成熟的抑制,还是从胚胎发育和胞质成熟来看,低温联合低浓度ROS抑制方案要好于高温联合高浓度ROS和CHX抑制方案。又因为低温下卵母细胞细胞质仍在进行活跃的胞质成熟活动,因此低温培养可以做为一种很好的抑制方法来提高卵母细胞胞质成熟。

目录

论文说明：符号说明

声明

1前言

1.1卵母细胞体外成熟

1.2卵母细胞减数分裂恢复的调控

1.2.1颗粒细胞、膜细胞和卵泡液抑制卵母细胞减数分裂恢复

1.2.2提高卵母细胞内cAMP水平抑制卵母细胞减数分裂恢复

1.2.3蛋白磷酸化抑制剂抑制卵母细胞减数分裂恢复

1.2.4蛋白质合成抑制剂CHX抑制卵母细胞减数分裂恢复

1.3低温对卵母细胞的影响

1.4细胞周期概述及成熟促进因子MPF(maturation promoting factor，MPF)

1.5卵母细胞成熟过程中皮质颗粒的变化

1.6微管、微丝与卵母细胞成熟

1.7卵母细胞生发泡(GV)染色质构型与卵母细胞的成熟

1.8论文主要研究内容

2材料与方法

2.1卵母细胞的获取

2.2卵母细胞培养

2.3卵母细胞孤雌激活

2.4体外受精

2.5胚胎的体外培养

2.6核形态的判定

2.7卵母细胞内生发泡(GV)染色质构型观察

2.8免疫荧光显微技术

2.9数据统计分析

3结果

3.1 5℃不同液体培养对卵母细胞减数分裂的抑制

3.2 5℃不同液体抑制后转为正常培养24小时卵母细胞成熟情况

3.3 5℃不同液体抑制24H后卵母细胞的生发泡染色质构型

3.4培养温度对卵母细胞减数分裂恢复的影响

3.5不同温度下添加ROS对卵母细胞减数分裂恢复的抑制

3.6不同温度抑制方案抑制后卵母细胞的成熟、激活、孤雌胚胎发育情况

3.7不同温度抑制方案抑制后成熟卵母细胞的体外受精胚胎发育情况

3.8不同温度抑制方案抑制后成熟卵母细胞的体外受精率

3.9不同温度抑制方案抑制后处于GV期卵母细胞内GV染色质构型的研究

3.10不同温度抑制方案抑制后转为正常培养卵母细胞的核成熟进程

3.11不同温度抑制方案对卵母细胞皮质颗粒分布的影响

3.12不同温度抑制方案对卵母细胞α-微管的影响

3.13 CHX抑制山羊卵母细胞减数分裂的最适浓度

3.14 CHX抑制后转为正常培养卵母细胞的成熟、激活和孤雌胚胎发育情况

3.15 CHX抑制后成熟卵母细胞体外受精情况

3.16 CHX抑制对卵母细胞皮质颗粒的影响

3.17 CHX抑制对卵母细胞α-微管的影响

3.18 CHX抑制对卵母细胞微丝的影响

4讨论

5结论

6参考文献

图版及图版说明

8致谢

9个人简历