MAPK在用初级精母细胞核取代生发泡的重构卵成熟和原核形成中的调控作用

摘要

辅助生殖技术在治疗雌雄生殖不育方面是非常有效的。卵巢刺激并结合IVF或ICSI目前已经成为治疗卵巢周期异常、输卵管疾患、精子抗体症、少精或无精症方面的常用方法。但是,对于那些不能产生具有受孕能力配子的患者来说(如患有卵巢异常或卵子缺陷的妇女和患有精子发生失败的男子),目前还没有办法获得他们自己遗传基因的后代,只能使用捐赠的配子或胚胎来治疗。近年来,来源于克隆的一种独特技术-体细胞单倍体化可能为那些不能产生配子的不育患者提供治愈的机会。体细胞单倍体化是指体细胞(二倍体)被诱导进入减数分裂而使二倍体的染色体形成单倍体的过程。由于哺乳动物卵母细胞能够提供减数分裂的胞质,比较适合用来进行体细胞单倍体化。卵母细胞在体外很容易获得,而且近年来显微操作技术也不断地完善,因此体细胞单倍体化是可以发生的。但是,使用体细胞进行单倍体化形成人工配予以及使用它正常受精的报道甚少。到目前为止,还没有子代成功出生的报道。很多报道都显示,体细胞在卵母细胞内发生单倍体化过程中出现许多异常现象,如染色单体不能正确地分离、细胞骨架系统遭到破坏、MII期染色体凝集能力较差以及蛋白激酶活性偏低等。因此,有必要对体细胞单倍体化过程中所发生的减数分裂事件进行较为系统的研究。 本实验采用体外培养、药物处理、激光共聚焦显微术以及蛋白激酶活性分析等方法系统地研究了初级精母细胞核替换生发泡(GV)后的重构卵在体外成熟以及激活期间所发生的减数分裂事件；同时,检测了重构卵中MAPK活性以探讨重构卵减数分裂调控的分子机理。主要实验结果如下； 1. Gv互换重组的卵母细胞成熟率与未经显微操作的裸卵无差异,而且都无大极体形成,染色体100％凝集,说明我们的显微操作系统对卵母细胞没有造成伤害。 2. 初级精母细胞(PS)植入GV期卵胞质后,能够完成第一次减数分裂,但很多重构卵都排出异常大的第一极体,染色体也不能完全凝集。初级精母细胞质的量对重构卵的成熟率、大极体形成以及染色体的凝集都没有影响。在重构卵成熟期间用OA处理显著减低大极体的形成比例,提高含有完全凝集染色体卵母细胞的比例；成熟期间使用U0126处理重构卵大极体比例显著升高,但不影响染色体凝集。 3. 重构卵第一极体排出的速度加快,发生在注核后4.5-6.5h,比对照组裸卵和GV互换卵早4h。 4.重构卵排出第一极体后老化40h,第一极体几乎不发生退化,而大多数对照组裸卵和GV互换卵的极体都已退化。在成熟期间添加OA,能够提高重构卵第一极体的退化率,但是在激活前使用U0126处理却不增加极体退化率。使用OA和U0126联合处理(即在成熟期闻添加OA,在激活前再添加U0126),重构卵极体退化率与单独使用OA组差异不显著。说明调控极体退化的事件只发生在成熟期间,一旦极体排出,任何处理都无效。 5.重构卵的激活率和原核形成率与GV互换组相比都显著降低。在成熟期间添加OA或激活前添加U0126处理后,重构卵激活率以及原核形成率显著升高,而且两种处理之间没有差异。使用二者联合处理(即先在成熟期间添加OA,然后在激活前添加U0126)后,重构卵的激活率以及原核形成率显著高于单独使用OA或U0126处理组。 6. 通过抗-lamina抗体染色后,核纤层蛋白在原核外周着色的强弱分为三种,即高度着色、中等着色和不着色。对照组裸卵和OV互换组中核纤层蛋白都发生高度着色。但是重构卵(GV+PS)中核纤层蛋白只发生中等着色。使用OA和U0126分别在重构卵成熟期间以及激活前处理,都能明显提高核纤层蛋自在原核中的表达,OA处理组要比U0126组效果好。使用OA和U0126组合共同处理效果更明显。 7.在MII期,重构卵的MAPK和MPF活性都显著低于GV互换卵。在成熟期间使用OA或U0126处理后,分别提高或降低成熟重构卵中的MAPK活性,但对MPF活性没有影响。说明重构卵中大极体的产生、极体不发生退化及染色体完全凝集能力较差可能是由于成熟期间MAPK活性低造成的。 8.从MII期到激活前(老化12h)和激活后(原核期),GV互换卵MPF活性逐渐下降,但重构卵中MPF活性下降幅度明显小于OV互换卵。在成熟期间添加OA或激活前使用U0126处理后,重构卵中MPF活性没有发生显著变化。 9. 从MII期到激活前和激活后,GV互换卵MAPK活性逐渐下降,但重构卵MAPK活性在此期间不发生显著下降。应当指出,MII期重构卵中MAPK活性本来就比GV互换卵低很多。成熟期间添加OA显著提高MII期重构卵的MAPK活性,因此在激活前重构卵中MAPK活性也明显下降。在激活前使用U0126处理后,重构卵中MAPK活性显著下降。在成熟期间添加OA,然后在激活前添加U0126处理,重构卵中MAPK活性下降的幅度显著高于单独使用OA或U0126处理组。 10. 总之,体细胞单倍体化的重构卵出现减数分裂异常(如大极体、染色体凝集不好等)、第一极体不退化以及激活后不能形成原核等异常现象。检测MAPK活性和用调节MAPK活性药物处理证明,这些异常可能与成熟卵母细胞的MAPK活性及其在老化和激活后的变化有关。

目录

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英文文摘

1前言

1.1体细胞单倍体化

1.1.1体细胞染色体不能正确分离

1.1.2重构卵中细胞周期检验点不够完善

1.1.3重构卵中胞质分裂出现异常

1.1.4重构卵中染色体完全凝集、微管组装双极纺锤体的能力较差

1.1.5重构卵激活能力较差

1.1.6重构卵中第一极体不发生退化

1.1.7重构卵中MPF和MAPK活性的变化

1.2蛋白激酶在哺乳动物卵母细胞成熟和受精过程中的作用

1.2.1卵母细胞成熟与激活

1.2.2 MAPK在哺乳动物卵母细胞成熟中的作用

1.2.3 MAPK在受精后的作用

2材料与方法

2.1实验小鼠和试剂

2.2卵母细胞、初级精母细胞以及卵丘细胞的获取

2.2.1 GV期卵母细胞

2.2.2 Pro-MI卵母细胞的获取

2.2.3卵丘细胞的获取

2.2.4初级精母细胞获取

2.3 GV互换

2.3.1显微操作

2.3.2 GV-胞质体复合体的融合

2.4初级精母细胞或卵丘细胞胞质内直接注射

2.5卵母细胞成熟、大极体形成以及凝集染色体的分布

2.6成熟期间卵母细胞核进程的判定

2.7第一极体形态学观察

2.8 OA和U0126处理

2.9卵母细胞激活

2.10 ICSI

2.10.1精子的准备

2.10.2 ICSI程序

2.11 IVF

2.12原核形成的判定

2.13免疫细胞化学

2.13.1微管、微丝、染色体三重染色

2.13.2核纤层、染色体双重染色

2.14 MPF活性检测

2.15 MAPK活性检测

2.16数据分析

3结果

3.1不同成熟阶段的胞质受体、不同类型的供核细胞以及供核细胞胞质对重构卵成熟率、极体形成以及染色体凝集的影响

3.2含有不同类型第一极体的成熟重构卵中凝集染色体分布

3.3重构卵(GV+PS)体外成熟期间的核进程

3.4不同类型的重构卵中第一极体排出时间

3.5重构卵(GV+PS)在成熟期间添加OA和U0126对第一极体形成、染色体凝集影响

3.6成熟重构卵中形成双极纺锤体的能力

3.7重构卵成熟期间以及激活前添加OA和/或U0126对第一极体退化的影响

3.8重构卵在成熟期间微丝、微管的分布

3.9不同的激活方案对成熟重构卵第二极体和原核形成的影响

3.10不同成熟阶段胞质受体、不同类型供核细胞对成熟的重构卵激活率的影响

3.11重构卵(GV+PS)成熟期间以及激活前分别添加OA和U0126对激活率的影响

3.12在重构卵成熟期间和激活前使用OA和U0126处理对形成原核的重构卵中核纤层蛋白表达的影响

3.13不同类型的成熟重构卵中MAPK和MPF的活性

3.14重构卵(GV+PS)在成熟期间添加OA和U0126后对MAPK和MPF活性的影响

3.15重构卵(GV+PS)在成熟期间、激活前分别添加OA和U0126后MAPK和MPF的活性

3.16不同类型的成熟重构卵中在成熟、激活前后MAPK和MPF的活性变化

3.17不同受体胞质和供核细胞对重构卵发育能力的影响

3.18去核与注核的时间间隔、成熟期间和激活前添加OA和U0126对重构卵发育能力的影响

4讨论

4.1重构卵能够排出第一极体

4.2大极体的形成

4.3第一极体排出的速度加快

4.4重构卵中纺锤体组装、微丝富集及染色体凝集

4.5重构卵中极体不退化

4.6重构卵的激活

4.7 MPF和MAPK在重构卵中的变化

5结论

6参考文献

7图版及图版说明

8致谢

9作者简介以及发表论文情况