泡桐丛枝病植原体延伸因子tuf基因分析及其他寄主植物的检测

摘要

论文包括泡桐丛枝病植原体南阳分离物(PaWB)延伸因子(EF-TU)基因tuf的研究、泡桐丛枝病田间寄主的检测和鉴定及其他两种植物病害的植原体检测三方面研究内容。 根据GenBank中已登录的植原体延伸因子tuf基因的保守核苷酸序列设计特异引物,扩增得到泡桐丛枝病植原体(PaWB)南阳分离物的tuf基因,核苷酸长度1185bp,编码394个氨基酸的完整蛋白序列,大小约为43 kDa。利用蛋白分析软件TMHMM 2.0和PROST II预测此植原体tuf为非跨膜蛋白且定位于植原体细胞质中。将PaWB tuf基因连接到pGEX-4T-3表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达出分子量约62 kDa含有GST标签的融合蛋白。用该融合蛋白免疫德国大白兔获得了特异性较高的抗血清。用不同的方法对泡桐丛枝病株制备的抗原进行ELISA和Dot blotting的结果进一步显示了tuf蛋白具有与膜结合的特性,对提取抗原的冻融处理是获得理想ELISA结果的重要前提条件。Western blot和间接免疫荧光分析表明,该抗血清分别与PaWB、PeV和CWB植原体抗原产生特异免疫反应,而与相应的健康植株对照及JWB、BWB植原体抗原无免疫反应。 用分子生物学的方法对泡桐丛枝病原的其他寄主进行了检测和鉴定。依据植原体16S rRNA基因设计的通用引物,采用巢式PCR检测了从泡桐丛枝病树附近采集的不同植物上的30份样品。从其中8种植物中扩增到长为1246bp的片段,序列分析表明它们都属于16SrI-D亚组,与泡桐丛枝病植原体的同源性最高,初步推断这8种植物是泡桐丛枝病的其他寄主。其中牛筋草(Eleusine indica)、狗尾草(Setaria viridis)、山药(Dioscoreaopppsita)、灯笼泡(Physalis angulata)、南瓜(Cucurbita moschata)、楸树(Catalpa bungei)6种植物是首次报到植原体病害；并且从辣椒(Capsicum annuum)和花生(Arachis hypogaea)中检测到的植原体与以往文献报道的辣椒僵顶病及花生从枝病病原植原体不同。本研究还在楸树叶片黄化(CbY)样品中扩增到了植原体的tuf基因,其序列同源性也与泡桐丛枝病植原体最高。DAPI荧光显微镜和间接免疫荧光显微镜观察结果表明,楸树黄化植原体与PaWB-NY tuf抗血清产生特异免疫反应,并且楸树黄叶组织中的植原体含量明显低于泡桐丛枝病组织。 从河北承德采集表现异常的丁香黄叶和北京采集到的黄金槐短枝样品中,通过巢式PCR扩增到了植原体16S rRNA基因,克隆测序,得到了长度为1246bp的核苷酸序列,初步证明了采集样品中含有植原体。序列分析和RFLP分析显示黄金槐短枝(SclS)植原体属于16SrⅠ-D亚组。丁香黄化(SoY)植株上植原体与猪屎豆丛枝植原体同源性最高,属于16SrⅡ-A亚组,与报道的引起紫丁香丛枝病的病原不同。在丁香簇叶样品(SoP)中检测到两种植原体,分别属于16SrⅠ-D亚组和16SrⅡ-A亚组,推断可能是这两种植原体的复合侵染。

目录

论文说明：符号说明

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第一章引言和文献综述

1植原体概述

1.1植原体的分类

1.2植原体的基因组

1.3植原体检测技术

1.4植原体蛋白延伸因子(EF-Tu)研究

1.5植原体的寄主范围的研究

2泡桐丛枝病研究

2.1发生和危害

2.2泡桐丛枝病病原及生物学

2.3泡桐丛枝病传播途径的研究

2.4泡桐-植原体互作关系研究

2.5泡桐丛枝病的防治技术

3本研究的立论依据、研究内容及意义

3.1立题依据

3.2研究内容及意义

第二章泡桐丛枝病植原体南阳分离物延伸因子tuf基因原核表达、抗血清的制备及其血清学关系比较

1.材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1 PaWB-NY tuf基因的克隆与序列分析

2.2 PaWB-NY tuf基因的原核表达及抗血清的制备

2.3血清学反应

3.结论与讨论

3.1植原体抗血清的制备

3.2序列分析结果与血清学关系

3.3三种血清学方法的比较

3.4几种抗原制备方法的比较

3.5 PaWB-NY tuf蛋白的预测分析

第三章泡桐丛枝病原其他寄主的检测与鉴定

1.材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1采集作物、杂草和树木症状表现及采集地生境

2.2采集样品的16S rRNA基因PCR检测结果

2.3 CbY植原体的tuf基因的PCR扩增

2.4 PCR产物的克隆及重组质粒PCR鉴定结果

2.5 16S rRNA基因序列测定及分析

2.6 CbY植原体tuf基因序列测定及分析

2.7 CbY组织DAPI染色荧光显微镜观察

2.8 CbY组织的间接免疫荧光观察

3.结论与讨论

第四章两种植物植原体病害的初步检测与鉴定

1.材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1采集植物材料

2.2 16S rRNA基因PCR检测结果

2.3 PCR产物的克隆及重组质粒酶切鉴定结果

2.4 16S rRNA基因序列测定及分析

2.5丁香簇叶中植原体16S rDNA序列SoP-2的RFLP分析

3.结论与讨论

参考文献

致谢

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