青杄中两个与花粉萌发和花粉管生长相关基因的分离和功能的研究

摘要

在显花植物授粉受精过程中，具顶端极性生长特性的花粉管是雄性生殖单位的载体，也是研究细胞生长分子调控机理的理想体系。与被子植物相比，裸子植物具有生长周期长，花粉管生长缓慢、易分叉等特点，具有不同于被子植物花粉发育的独特发育模式。对于裸子植物花粉萌发和花粉管生长的调控机理，目前尚不十分清楚。本文以松类植物中比较有代表性的裸子植物青杆(Picea willsonii)花粉为试材，构建青杆花粉和花粉管的cDNA文库，并通过RT-PCR方法克隆到微管蛋白基因TUA1，从Ca2+诱导青杆花粉cDNA文库中分离得到CCAAT框结合蛋白类型的转录因子基因HAP5。对这两个基因进行表达分析和功能鉴定，结果如下： 1.利用Clontech SmartTM cDNA Library Construction Kit构建青杆花粉及花粉管的cDNA文库，根据同源序列设计兼并引物，通过RT-PCR的方法获得微管蛋白基因TUA1的中间片段，经5'-和3'-RACE PCR，得到其全长cDNA，为1721bp，编码区全长为1353bp，编码含451个氨基酸的多肽，分子量为49.58kDa。在Ca2+诱导的青杆花粉cDNA文库中筛选得到基因PwHA.P5，该基因编码一个CCAAT框结合蛋白类型的转录因子，cDNA全长为985bp，编码区全长为603bp，编码含201个氨基酸的多肽，分子量为22.44kDa。 2.同源序列比较发现，青杆的微管蛋白基因TUA1与拟南芥、水稻、棉花和花旗松的微管蛋白有高度的序列同源性，分别为88.47％、96.9％、97.78％和99.78％。聚类分析表明PwTUAl属于I类α微管蛋白。青杆的转录因子PwHAP5与拟南芥、水稻、酵母和人类HAP5的关键结构域都比较保守，与拟南芥的AtNF-YC9(AtHAP5C)和水稻的OsHAP5A/B亲缘关系较近。 3.半定量RT-PCR分析表明PwTUA1在青杆花粉中特异表达，且表达水平随着花粉萌发过程逐渐升高，12小时达最高值，随后逐渐下降，并且在花粉萌发的各阶段均受到Ca2+和硼的诱导。PwHAP5在青杆花粉、针叶、茎和根中均有表达，随着花粉萌发时间延长，表达量逐渐升高，18小时达峰值后一直保持不变，在不同萌发时段PwHAP5表达均受Ca2+的诱导。 4.在青杆花粉中超表达PwTUA1可以提高花粉的萌发率和花粉管的生长速度，而超表达PwHAP5可以改变花粉管生长方向。 5.在拟南芥中组成型超表达PwTUA1使得转基因植株生长迟缓，出现螺旋生长，甚至由于不能够完成形态建成而死亡。在拟南芥花粉中专一表达PwTUA1可以促进花粉的萌发和花粉管生长，即使是在Ca2+和硼浓度非最适培养基中同样可以起到促进作用，并且PwTUA1在拟南芥花粉中的表达改变了TUA蛋白(微管蛋白α亚基)在花粉管中的分布模式以及花粉管的超微结构。野生型拟南芥中TUA蛋白主要定位于除花粉管尖端区域以外的整个花粉管中，而在转基因拟南芥花粉管的顶端区域有大量的TUA蛋白存在。野生型拟南芥花粉管壁远远厚于转基因拟南芥，在转基因拟南芥花粉管顶端存在许多短的游离的胞质微管，并且富集小泡，而在野生型拟南芥花粉管的相应位置中没有发现这些结构。 6.在拟南芥中超表达PwHAP5后，会影响果荚的排列，但不影响花粉管的生长方向。用青杆转录因子PwHAP5的N末端77个氨基酸、C末端130个氨基酸及全长分别做诱饵筛选青杆花粉和花粉管cDNA文库，共得到约80个克隆，经重新验证活性后，选择结合活性较强的克隆测序。在测序结果中筛选到7个与PwHAP5全长、N端和C端均相互作用的克隆。GenBanK中Blast结果发现这些克隆与拟南芥基因组中的同类基因有较高同源性。选择其中的PwFKBP12蛋白与PwHAP5通过双分子荧光互补实验进行体内互作的验证。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写符号及其中英文对照表

声明

1.前言

1.1花粉管的结构

1.1.1花粉管的生长特点

1.1.2花粉管细胞壁的一般结构

1.1.3花粉管细胞壁的化学组成

1.1.4裸子植物与被子植物花粉管结构及特征上的异同

1.2微管

1.2.1微管的结构

1.2.2微管的功能

1.2.3花粉管中的微管骨架系统

1.2.4微管蛋白基因

1.3转录因子

1.3.1植物转录因子的结构

1.3.2转录因子活性的调控

1.3.3植物转录因子的类型及其与其它真核生物转录因子的比较

1.3.4 HAP类转录因子研究进展

1.4本研究的目的与意义

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2植物材料培养与处理

2.1.3载体与菌株

2.1.4其它材料

2.1.5实验引物

2.2实验方法

2.2.1 RNA的提取

2.2.2 RNA的纯化

2.2.3 cDNA第一链的合成

2.2.4双链cDNA的合成

2.2.5蛋白酶K消化dscDNA

2.2.6 Sfi I消化dscDNA

2.2.7双链文库DNA的纯化

2.2.8 cDNA与λTriplEx2载体连接、包装及效价测定

2.2.9 DNA片段与克隆载体的连接

2.2.10大肠杆菌DH5α感受态的制备

2.2.11大肠杆菌细胞的转化

2.2.12质粒DNA的提取

2.2.13凝胶电泳中DNA片段的回收

2.2.14序列测定

2.2.15 PwTUAl cDNA全长的获得

2.2.16半定量RT-PCR（Semiquantitative-RT-PCR）

2.2.17基因枪法瞬时转化青杆花粉

2.2.18植物表达载体的构建与拟南芥转化

2.2.19拟南芥花粉体外培养和花粉管长度的测量

2.2.20间接免疫荧光显微镜定位

2.2.21透射电镜观察

2.2.22酵母双杂交

2.2.23双分子荧光互补实验表达载体构建

2.2.24本生烟草叶片瞬时转化

3.结果与分析

3.1青杆花粉和花粉管cDNA文库的构建

3.1.1青杆花粉及花粉管RNA的提取

3.1.2文库构建及效价测定

3.1.3文库检测

3.2青杆微管蛋白α亚基基因PwTUAl的克隆与相关功能分析

3.2.1 PwTUAl基因的克隆

3.2.2 PwTUAl的序列分析

3.2.3 PwTUAl的表达分析

3.2.4青杆微管蛋白基因PwTUAl的功能鉴定

3.3青杆PwHAP5基因的克隆与相关功能研究

3.3.1 PwHAP5基因的克隆

3.3.2PwHAP5的序列分析

3.3.3 PwHAP5的表达分析

3.3.4 PwHAP5'基因相关功能分析

3.3.5与青杆转录因子PwHAP5相互作用蛋白的筛选及鉴定

4.讨论

4.1花粉特异的青杆微管蛋白参与花粉萌发和花粉管生长过程

4.2 PwTUA1可能参与钙离子和硼对花粉萌发和花粉管生长的调控过程

4.3 PwTUA1通过改变TUA的分布及花粉管的超微结构来促进花粉管的生长

4.4.PwHAP5参与调控花粉管的生长

4.5 PwHAP5通过与其它蛋白相互作用共同调控植物的生长发育

5.结论

参考文献

附录

致谢

附：攻读学位期间发表的论文及成果

发表论文一

发表论文二