抗坏血酸及钙信号在Elicitin诱导烟草细胞死亡中的作用

摘要

植物受非亲和病原物侵染或激发子等因子刺激可发生过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death，HCD)，HCD是植物对外界刺激的一种主动反应。在HCD过程中，植物体发生一系列事件，如氧化迸发、离子流等，各种事件通过某些尚不完全清楚的机制，参与调节HCD的发生。 Elicitins是一类由卵菌分泌的，分子量约为10kDa的蛋白质激发子。Elicitins有α型(酸性)和β型(碱性)，寄生疫霉(Phytophthora parasitica)产生的Elicitin为α型，称为parasiticein。我们实验室已从烟草黑胫病菌(P.parasitica)中克隆了编码Elicitin的基因并体外表达了该蛋白，对该激发子诱导的烟草细胞死亡的特征做了初步研究，本文在前期研究基础，以Elicitin和烟草悬浮细胞为互作体系，探讨抗氧化剂抗坏血酸(ASA)以及钙通道在Elicitin诱导的烟草细胞死亡中的作用。所得结果如下： 1.抗坏血酸(ASA)可减弱Elicitin诱导的烟草细胞死亡和H2O2的积累 用Trypan blue法测定了Elicitin诱导的烟草细胞死亡，100nmol/L的Elicitin处理烟草细胞后24 h，死亡率为69.6％，而ASA+Elicitin处理的细胞死亡率为46.4％，比单独Elicitin处理的死亡率下降23.2％。 荧光光度计法测定了Elieitin诱导的烟草细胞H2O2的变化，发现Elicitin诱导后2 h，细胞出现一个明显的H2O2积累，而加入抗坏血酸(ASA)后，H2O2的积累量明显降低。表明ASA可能通过减轻烟草H2O2的积累减弱Elicitin诱导的细胞死亡。 2.抗坏血酸(ASA)对Elicitin诱导的APX和CAT活性及其基因表达的影响 抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(CAT)是植物体内重要的H2O2清除酶，在植物细胞内通过清除多余的H2O2维持胞内氧化平衡，减轻H2O2对细胞的损伤。为分析ASA是否通过影响CAT和APX的活性调节H2O2的积累，测定了不同处理对两种酶活性及其基因表达的影响。结果表明，未经任何处理的烟草细胞中APX和CAT酶一直处于较高的活性状态，而用Elicitin处理后2 h，APX和CAT活性迅速下降，在所有测定的时间段内，两种酶活性一直很低。与Elicitin单独处理的情况不同，经ASA预处理再用Elicitin诱导的烟草细胞，APX和CAT酶活性虽然低于对照，但却高于Elicitin诱导的结果。RT-PCR法检测了编码两种酶基因的诱导表达，也发现类似的现象。这一结果说明，Elicitin诱导的烟草H2O2的积累可能与两种酶活性降低有关，而ASA可能通过逆转两种酶活性衰减H2O2.从而减轻Elicitin诱导的细胞死亡。 3.抗坏血酸(ASA)对Elicitin诱导的烟草hsr203J和hin1基因表达的影响 hsr203J和hin1是HCD的两个标志基因，采用半定量RT-PCR法分析了各处理对hsr203J和hin1表达的影响。结果发现，Elicitin可诱导烟草hsr203J和hin1在转录水平的积累，ASA处理可减缓Elicitin对hsr203J、hin1诱导表达。 4.钙离子通道抑制剂对Elicitin诱导的烟草细胞死亡的作用 Ca2+是植物细胞内的重要信号分子，对各种刺激都有明显而快速的反应。为了解钙信号是否参与Elicitin诱导的烟草细胞死亡，选用了2种钙离子通道抑制剂氯化镧和EGTA，观察其对细胞死亡的影响。结果发现，氯化镧和EGTA可明显减轻Elicitin诱导的细胞死亡率，表明Elicitin诱导的烟草细胞死亡，可能有Ca2+的参与。 5.钙离子通道抑制剂对Elicitin诱导的烟草细胞产生活性氧及hsr203J和hinJ的影响 在烟草悬浮细胞中添加Ca2+抑制剂，荧光光度计法测定了各处理对H2O2抑制的情况。结果表明，EGTA能够完全抑制由Elicitin引发的H2O2积累，LaCl3则只有部分抑制作用。 hsr203J和hin1是HCD的两个标志基因，采用半定量RT-PCR法分析了各处理对hsr203J和hin1表达的影响。结果发现，Elicitin可诱导烟草hsr203J和hin1在转录水平的积累，氯化镧(Lanthanum chloride)和EGTA处理可减缓Elicitin对hsr203J、hin1诱导表达。 上述结果表明，Ca2+信号参与了Elicitin诱导的烟草细胞死亡过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一部分 文献综述

第一章 Elieitins研究进展

1 引言

2 Elicitins的发现

3 Elieitins的生物学作用

4 Elieitins诱导的防卫信号传导

5 Elieitins在疫霉菌致病性和生活史中的作用

第二章 活性氧与植物的抗病性及其清除

1 活性氧的化学反应

2.植物与病原物不亲和互作中的活性氧进发动态

3.O2-的产生和积累

4.H2O2的产生和积累

5.活性氧进发与植物细胞胞外介质碱性化

6 活性氧清除机制

第三章 植物细胞信号分子：Ca2+研究进展

1.Ca2+在植物细胞信号分子中的地位

2.Ca2+转运系统

3.Ca2+信号转导的调控机制

第二部分 研究内容

第一章：抗坏血酸(ASA)对Elicitin诱导烟草细胞死亡的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3、结论与讨论

第二章 钙通道在Elicitin诱导的烟草细胞死亡中的作用

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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