中药提取物免疫调节作用的研究及多糖的提取分离鉴定和分子量测定

摘要

畜禽疾病特别是病毒性疾病仍然是阻碍养殖业健康发展的瓶颈，疫苗是防治疾病最有效的方法。但是，近几年由于免疫抑制性病毒的普遍存在，预防工作变得异常艰难，国内外学者一直致力于研究提高疫苗的特异性和非特异性免疫增强作用。中药是我国传统文化的结晶，是中华民族的文化瑰宝，在畜禽疾病的防治过程中起过重要的作用。中药免疫增强剂对机体的细胞免疫和体液免疫功能具有增强或调节作用，可提高机体的抗病力和抵抗力，显示了显著增强机体免疫的作用。本研究以临床上常常发生的网状内皮组织增生症病毒（REV）感染雏鸡，造成一定程度的免疫抑制，建立试验动物模型，比较中药提取物对不同免疫状态下鸡的免疫调节作用，并对主要成分多糖进行提取分离鉴定和分子量测定，为下一步多糖的结构和功能研究奠定基础。
　　 1.中药提取物免疫调节作用的研究
　　 1.1中药提取物和盐酸左旋咪唑对鸡的免疫调节作用
　　 分别在临床健康鸡和在1日龄感染网状内皮增生症病毒（REV）诱发了免疫抑制的鸡测试了中药提取物和盐酸左旋咪唑对鸡的免疫调节作用，以及对鸡体重、免疫器官的影响。结果表明，在饮水中添加50ppm的盐酸左旋咪唑，无论在健康鸡还是免疫抑制鸡对NDV、H5-AIV灭活疫苗免疫后的HI抗体水平、体重和免疫器官指数都没有显著影响（p>0.05）。由黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的提取物饲喂健康鸡对NDV和H5-AIV免疫后的HI抗体水平也没有显著影响（p>0.05）。但是在REV诱发了免疫抑制的鸡，相对于不喂中药提取物的对照组，该中药提取物可显著提高对NDV、H5-AIV的HI抗体水平和免疫器官指数（p＜0.01），虽然仍显著低于未经REV感染的对照鸡。该研究表明，由黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的提取物对REV诱发的免疫抑制状态下的鸡有显著的免疫增强作用，盐酸左旋咪唑没有免疫增强作用。
　　 1.2不同组合中药提取物对鸡的免疫调节作用
　　 分别在临床健康鸡和在1日龄感染网状内皮增生症病毒（REV）诱发了免疫抑制的鸡测试了不同浓度黄芪提取物和由黄芪、党参、淫羊藿、甘草组成的不同组合的中药提取物对鸡的体液免疫调节作用，以及对鸡体重、免疫器官的影响。结果表明，不同浓度的单一黄芪提取物对NDV和H5-AIV免疫后的HI抗体滴度没有显著影响，对鸡的体重、免疫器官指数也没有显著影响（P>0.05）。由黄芪、党参、淫羊藿和甘草混合物组成的中药提取物，在健康鸡对NDV和H5-AIV灭活疫苗免疫后的HI抗体滴度没有显著影响。但是在REV诱发了免疫抑制的鸡，该混合中药提取物可显著提高对NDV和H5-AIV的HI抗体滴度（p<0.01），虽然仍显著低于未经REV感染的对照鸡。该中药制剂还可以显著增加胸腺和法氏囊指数，即缓和由REV诱发的萎缩。该研究表明，单一黄芪不能提高由REV诱发的免疫抑制鸡的抗体水平，黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的中药提取物对REV诱发的免疫抑制鸡具有显著的免疫增强作用。
　　 1.3不同提取方法中药提取物对鸡的免疫调节作用
　　 分别在临床健康鸡和1日龄感染网状内皮组织增生症病毒（REV）诱发了免疫抑制的鸡测试了经不同提取方法获得的中药提取物的免疫调节作用，并研究水溶性提取物对不同来源鸡的免疫调节作用。结果表明，在饮水中添加由黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的提取物，无论是水溶性提取物（水提取物和乙醚提取后的水提取物）还是脂溶性提取物（乙醚提取物），对健康鸡NDV和H5-AIV灭活疫苗免疫后HI抗体水平均无显著影响（P>0.05），水溶性提取物对REV诱发的免疫抑制鸡的NDV和H5-AIV灭活疫苗免疫后HI抗体水平有显著影响（p<0.01），可显著提高其抗体水平。但是，由同样药物组成的脂溶性提取物却没有免疫增强作用（P>0.05）。中药提取物对健康鸡和SPF来源继续在SPF下饲养的鸡对NDV和H5-AIV灭活疫苗免疫后的HI抗体滴度没有显著影响（p>0.05）。但是在REV诱发了免疫抑制的鸡和SPF来源在非SPF条件下饲养的鸡，该中药提取物可显著提高对NDV和H5-AIV的HI抗体滴度（p<0.01），虽然仍显著低于未经REV感染的对照鸡。
　　 1.4不同分子量段中药提取物对鸡的免疫调节作用
　　 用网状内皮增生症病毒（REV）感染海蓝褐公鸡和SPF来源的鸡诱发免疫抑制，在饮水中添加中药提取物或不同分子量段的中药提取物，测试其对鸡的免疫调节作用。结果表明，同样由黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的提取物和分子量段在1-10万道尔顿的提取物，不论是先混合、提取再超滤、浓缩还是先分别提取、超滤再浓缩、混合可显著提高感染REV鸡的NDV和H5-AIV的HI抗体滴度（p<0.01），虽然仍显著低于未经感染REV的对照鸡。但分子量小于1万道尔顿和大于10万道尔顿的提取物，对感染REV的免疫抑制鸡没有显著免疫增强作用（p>0.05）。试验结果还表明，中药提取物和分子量在1-10万道尔顿的提取物对SPF来源的鸡在非SPF环境下饲养有显著的免疫增强作用（p<0.05），对同样是SPF来源的鸡继续在SPF环境下饲养却没有显著的免疫增强作用（p>0.05）。该研究表明，由黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的提取物其免疫增强作用的分子量在1-10万道尔顿之间，而对SPF来源继续在SPF环境下饲养的鸡没有显著免疫增强作用。
　　 1.5中药提取物对鸡外周淋巴细胞转化率的影响
　　 为了检测中药提取物对外周淋巴细胞转化率的影响，采用中药提取物对感染网状内皮组织增生症病毒（REV）鸡外周血液、胸腺和脾脏淋巴细胞转化率进行试验，建立MTT法来观察淋巴细胞的转化率。结果显示，REV显著抑制雏鸡血液、胸腺和脾脏淋巴细胞转化率（p<0.05）；中药提取物对健康雏鸡血液、胸腺和脾脏淋巴细胞转化率没有显著的影响（p>0.05），可显著提高由REV诱发的免疫抑制鸡35日龄前血液、胸腺淋巴细胞转化率和21日龄前脾脏淋巴细胞的转化率（p<0.05），对49日龄后血液、胸腺和35日龄后脾脏淋巴细胞转化率影响不明显（p>0.05）。
　　 2.多糖的提取分离鉴定和分子量测定
　　 2.1中药提取物化学成分初步鉴定
　　 本试验用中药提取物化学成分的鉴定方法鉴定了由黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的用不同方法提取的混合物的成分。结果表明，用水浸提后得到的提取物含有鞣质、多糖及其苷类、皂苷、氨基酸、多肽和蛋白质，用乙醚浸提后得到的提取物含有生物碱、黄酮及其苷类、挥发油、油脂类，用乙醚浸提后再用水浸提得到的提取物和用水浸提后得到的提取物成分相同，水浸提后的提取物用超滤膜过滤后，分子量小于1万道尔顿的提取物含有鞣酸、氨基酸、多肽和蛋白质，分子量在1-10万道尔顿的提取物中含有多糖及其苷类、皂苷、多肽和蛋白质，分子量大于10万道尔顿的提取物含有糖、多糖及其苷类、皂苷、多肽和蛋白质。水溶性成分和脂溶性成分的区别在于水溶性成分含有糖、多糖、皂苷，而脂溶性成分没有，证明多糖及其苷类和皂苷具有免疫增强作用。
　　 2.2中药粗多糖的提取参数研究
　　 本试验采用四因素三水平正交设计研究了提取温度（A），料液比（B），提取时间（C）及提取次数（D）对中药粗多糖得率的影响。最佳提取条件参数为A3B1C3D3，即浸提温度80℃，料液比1:10，浸提时间3h，提取次数3次。采用苯酚-硫酸法测得复方中药多糖提取物GCPS中多糖含量为48.45％，测试结果稳定可靠。苯酚-硫酸法是目前测定多糖含量较可靠的传统方法之一，本法简单快速，灵敏度高，重现性好。
　　 2.3中药多糖的分离纯化和分子量测定
　　 由黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的复方中药提取物，按Sevag法脱除蛋白质后得复方粗多糖GCPS。粗多糖分别用终浓度50％、60％和70％的乙醇沉淀，离心，干燥，得到三种多糖组分（GCPS-1、GCPS-2和GCPS-3）；将分级醇沉所得多糖组分分别进行DEAE-纤维素柱层析，得三种主要多糖GCPS-1A，GCPS-2A，GCPS-3A，分别进行TOYOPEARL HW-55F凝胶柱层析，得三种主要成分GCPS-1AⅠ，GCPS-2AⅡ，GCPS-3AⅢ。经过Sephadex G-200凝胶柱层析、紫外可见分光光度分析和纸层析鉴定，表明是均一组分，不含有核酸和蛋白质杂质；并测得均一组份GCPS-1AⅠ中的多糖含量为77.6％，GCPS-2AⅡ中的多糖含量为95.2％，GCPS-3AⅢ中的多糖含量为87.3％；根据已知分子量的标准葡聚糖Dextran系列的洗脱体积得到标准曲线方程：Y=-0.1734X+0.8676，R=0.9993，并根据标准方程测得GCPS-1AⅠ，GCPS-2AⅡ及GCPS-3AⅢ的相对分子质量（Mr）为301254、94541和12453。
　　 3.结语
　　 本研究首次应用REV作为免疫抑制因素建立试验动物模型，研究了由黄芪、党参、淫羊藿和甘草组成的提取物对不同免疫状态下雏鸡和SPF鸡的免疫调节作用，不同分子量段提取物的免疫调节作用，不同提取方法提取物的免疫调节作用，不同组合中药提双物的免疫调节作用，并与盐酸左旋咪唑进行了比较。还进一步研究了中药提取物对试验动物细胞免疫的调节作用。建立了应用REV作为测试中药提取物免疫增强作用的试验模型，证实了复方中药提取物的免疫增强作用。而且这种有效成分是水溶性的，分子量在1-10万道尔顿之间。但具体的化学成分还有待于进一步研究。
　　 本研究还对起主要免疫增强作用的化学成分多糖进行提取、分离和鉴定，探索了多糖的最佳提取条件，测试了均一多糖的含量和分子量。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写注释

基金项目

文献综述

第一章 免疫增强剂的研究进展

1 免疫增强剂的分类

2 常用的免疫增强剂

3 免疫增强剂作用机理

第二章 免疫抑制剂的研究进展

1 肾上腺皮质激素类

2 烷化剂类

3 抗代谢类药物

4 核苷酸还原酶或酪氨酸激酶抑制剂

5 钙神经氨基酶抑制剂

6 雷帕霉素靶分子抑制剂

7 生物药品和单克隆抗体

8 中药类

9 免疫抑制病毒

第三章 中药的化学成分及生物学特性

1 多糖类化合物的研究概况

2 黄酮类化合物的研究概况

3 皂苷类化合物的研究概况

4 二萜生物碱的研究概况

第四章 中药成分的免疫增强作用及机理的研究进展

1 中药制剂对机体体液免疫的影响

2 中药制剂对补体及细胞因子的影响

3 中药免疫增强剂对免疫活性细胞的影响

4 中药免疫增强剂对禽免疫器官的影响

第五章 中药有效成分的提取方法及意义

1 中药的有效成分

2 中草药有效成分的提取方法

3 中草药有效成分提取的意义

第六章 研制新型免疫增强剂的迫切性及本研究的目的和意义

1 研制新型免疫增强剂的迫切性

2 现有免疫增强剂的评价及理想的免疫增强剂应具备有以下几个特点

3 中草药免疫增强作用研究方向及应用前景

4 本研究的目的和意义

第一部分 中药提取物免疫调节作用的研究

试验一 中药提取物和盐酸左旋眯唑对鸡的免疫调节作用

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

试验二 不同组合中药提取物对鸡的免疫调节作用

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

试验三 不同提取方法中药提取物对鸡的免疫调节作用

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

试验四 不同分子量段中药提取物对鸡的免疫调节作用

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

试验五 中药提取物对鸡外周淋巴细胞增值反应的影响

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 多糖的提取分离鉴定和分子量测定

试验六 中药提取物化学成分初步鉴定

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4结论

试验七 中药粗多糖的提取条件优化研究

摘要

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

试验八 中药多糖的分离纯化和分子量鉴定

摘要

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

5 结论

总体结论

总体创新

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况