反向重复结构不同位置侧翼序列诱导的基因沉默差异比较

摘要

RNA沉默是生物(特别是真核生物)抵御外来核酸(病毒、转座子、转基因甚至人工注射的双链RNA)入侵的一种防御机制，它广泛存在于各种生物中。本研究主要内容是分别在植物表达载体pRIR202反向重复结构的上游、中间间隔区(Loop环)、下游插入GFP基因5'端的521 bp片段，通过瞬时表达系统比较反向重复结构不同位置侧翼序列诱导基因沉默的差异，从而为培育多抗病毒转基因植物，长时间高水平维持RNA介导的抗病性提供理论依据。 具体结果如下： 1.克隆GFP 5'端的521 bp片段，分别插入植物表达载体pRIR202反向重复结构的上游、中间间隔区(Loop环)、下游，成功构建了植物双元表达载体pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN，并用冻融法导入农杆菌C58C1中。 2.用农杆菌共浸润(渗入)的方法，将带质粒的农杆菌注射入带有GFP基因的单拷贝纯合体转基因烟草Nicotiana benthamiana line16C，以注射pRIR202为空白对照。在长波(365 nm)紫外灯照射下，4天后在注射pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN的部位都出现了红色晕圈，并且随时间变化红色部位逐步蔓延和加强，而且pRIR202MID和pRIR202DWN的沉默效果强于pRIR202UP。 3.利用实时荧光定量PCR技术，从分子水平检测基因沉默的强度，9天后检测GFP mRNA的相对累积量。注射pRIR202、pRIR202UP、pRIR202MID、pRIR202DWN的植株中的GFP mRNA积累量分别为1.0000、0.6598、0.4175和0.3209。23天后检测GFP mRNA的相对累积量，依次分别为1.0000、0.2169、0.1996和0.1654。通过分析比较可以得出基因沉默的强弱依次为pRIR202DWN、pRIR202MID和pRIR202UP。 4.利用Western blot从蛋白水平分析GFP的含量，以注射pRIR202的野生型烟草(N.benthamiana)为阴性对照，注射pRIR202的转基因烟草(N.benthamiana line 16C)为阳性对照，野生型烟草的烟草中检测不到GFP蛋白，而注射pRIR202、pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN的16C植株中都检测到TGFP蛋白，而且注射pRIR202的16C中GFP的蛋白含量明显多于注射pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN的16C烟草，注射pRIR202UP的16C烟草的GFP含量又多于注射pRIR202MID和pRIR202DWN的烟草。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

一 引言

1 RNA沉默

1.1 RNA沉默的发现

1.2 RNA沉默的分子机制

1.3参与RNA沉默相关的酶及其组成

1.4基因沉默的起始和维持

1.5 RNA沉默的应用前景

2绿色荧光蛋白研究进展

2.1绿色荧光蛋白的性质

2.2 GFP的应用

3农杆菌介导的瞬时表达体系

4荧光定量PCR研究进展

4.1荧光定量PCR原理

4.2荧光定量PCR的特点

4.3荧光定量PCR技术的应用

5本研究的立题依据和主要研究内容

5.1立题依据

5.2目的意义

5.3技术路线图

二材料与方法

1材料

1.1植物材料

1.2菌株和载体

1.3常用缓冲液及培养基的配制

1.4常用化学试剂分子生物学试剂

2方法

2.1 GFP目的基因片段的获得

2.2克隆载体构建

2.3植物表达载体的构建

2.4重组质粒的农杆菌转化

2.5农杆菌侵染植株

2.6植株表型的观察

2.7 GFP基因RNA水平分析

2.8 GFP蛋白质水平分析

三结果与分析

1目的片段的获得

1.1目的片段的扩增

1.2切胶回收目的片段

2重组克隆载体的鉴定

2.1重组中间载体的电泳

2.2重组中间载体的PCR鉴定

2.3重组中间载体的酶切鉴定

2.4 DNA序列测定

3植物表达载体的构建

3.1目的片段的酶切

3.2植物表达载体pRIR202的酶切

3.3目的片段与植物表达载体的连接转化

3.4重组植物表达载体的鉴定

4植株表型分析结果

4.1野生型和16C在紫外灯照射下的表型

4.2农杆菌共浸润叶片GFP基因沉默的表型

4.3农杆菌共浸润整个植株GFP基因沉默的表型

5 GFP基因的荧光定量PCR分析结果

5.1植物总RNA的提取结果

5.2荧光定量PCR产物电泳检测

5.3荧光定量PCR

6 GFP的Western分析结果

四讨论

五结论

参考文献

附录

致谢

在学期间发表论文和获奖情况