传染性支气管炎病毒的基因分型及S1基因和N基因遗传多样性分析

摘要

鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道病，主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。以临床症状复杂、病理变化多、血清型多和容易发生变异等为特征，是一种生产意义巨大、影响广泛的传染性疫病。
　　 IBV目前有20多个血清型，不同血清型之间缺乏交叉保护，但中和试验十分繁琐，从而给本病的诊断和防治带来困难。分子克隆测序是进行IBV分子病原研究的重要手段，通过生物信息学比较，可以快速了解IBV不同病毒之间、不同基因的演化趋势。
　　 本论文结合1992-2008年间从山东乃至全国分离鉴定的IBV毒株，在进行抗原性和致病性研究的基础上，对17株IBV毒株分别进行了S1基因和N基因的克隆测序。选取GenBank中具有代表意义的50多株参考株（含疫苗株），结合我们所测定的序列，分别进行核苷酸和氨基酸同源比较，进而分析探讨IBV S1和N基因之间遗传变异的相关性及其全长与片段遗传变异的相关性。结果表明：S1基因和N基因之间的遗传变异均具有多样性。与常规疫苗株和国外参考株相比，无论是核苷酸还是氨基酸均发生了较大的变异。以S1基因为例，17株IBV流行株仅有一株与疫苗株（H120）同源，比例较低（占5.88％）；与H120的nt/aa同源性均低于80％。不同IBV毒株S1基因片段与其全长之间遗传变异高度相关（r=0.963）；N基因呈现出与S1基因同样的规律性（r=0.976）!不同IBV毒株S1基因和N基因全长之间遗传变异高度相关（r=0.645），显示出S1基因和N基因之间的遗传变异既具有同步性，又具有一定的独立性!此外，IBV流行株与疫苗株的遗传距离，无论在S1基因还是N基因，愈来愈远，彰显出IBV流行株在H120的免疫压力下，已经发生了较大程度的变异。
　　 根据IBV流行株S1基因和N基因的核苷酸同源性，按病毒发生的年代和地域以及致病性，初步将S1基因和N基因分为6种基因型。比较发现：S1或N基因的分型结果十分相似。对同时具有S1和N基因的40株IBV毒株的分型结果比较显示：符合率75％（30/40），而差异仅25％（10/40），其分型差异最明显的是从2000年以来的IBV分离株，13株中有6株分型结果不一致，符合率仅仅53.8％，显示出S基因和N基因的遗传变异的多样性和复杂性，同时发现部分。IBV毒株间可能存在重组。

目录

文摘

英文文摘

符号及缩略词

1 引言

1.1 病原学

1.1.1 IBV的分类

1.1.2 理化性质

1.1.3 生物学活性

1.1.4 宿主系统

1.2 IBV的基因组

1.3 IBV的粒子结构

1.4 IBV的主要结构蛋白及功能

1.4.1 纤突蛋白（S）

1.4.2 膜基质蛋白（M）

1.4.3 核衣壳蛋白（N）

1.4.4 其他蛋白

1.5 IBV的复制机制

1.6 IBV的变异机制

1.6.1 重组与基因工程苗

1.7 IBV的血清型和基因分型研究进展

1.7.1 国外对IBV的分型研究

1.7.2 国内对IBV的分型研究

1.7.3 血清抗体分析

1.7.4 分子生物学分型

1.8 IBV的检测与防控

1.8.1 检测方法

1.8.2 防控技术

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 病毒的分离鉴定

2.1.2 毒株序列

2.1.3 参考毒株

2.1.4 器材与试剂

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 病毒的增值与浓缩

2.2.3 病毒基因组RNA的提取

2.2.4 RT-PCR

2.2.5 cDNA合成

2.2.6 PCR扩增

2.2.7 PCR产物的克隆和序列测定

2.2.8 序列分析

2.2.9 S1基因的基因分型

2.2.10 N基因的基因分型

2.2.11 S1基因和N基因的分型比较

2.2.12 免疫压力下的IBV毒株S1基因和N基因的遗传变异分析

3 结果和分析

3.1 病毒的分离鉴定

3.2 RT-PCR的扩增结果

3.3 重组质粒的鉴定

3.4 测序结果及核苷酸、氨基酸序列比较

3.5 同源性分析

3.6 IBV S1基因不同片段的nt/aa遗传变异相关性

3.7 IBV N基因不同片段的nt/aa遗传变异相关性

3.8 IBV不同毒株间S1和N基因的核苷酸变异相关性

3.9 IBV S1基因的基因分型结果

3.10 IBV N基因的基因分型结果

3.1 1 40株相同毒株S1基因和N基因的分型比较

3.12 免疫压力下的IBV毒株S1基因的遗传变异趋势

3.13 免疫压力下的IBV毒株N基因的遗传变异趋势

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

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