禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

摘要

禽戊型肝炎(HEV)是由禽戊型肝炎病毒(Avian Hepatitis E Virus)感染所致的病毒肝炎,主要经肠道传播,临床症状表现为为肝脾肿大,肝坏死,肝出血,卵巢退化,死亡率上升及产蛋率下降等。
　　 2001年,Haqshenas等从患有肝脾肿大(hepatitis-splenomegaly,HS)综合症的鸡胆汁中首次分离出禽HEV。自禽HEV发现以来,对禽HEV血清流行病学的调查已有了数篇的报道,但由于禽HEV和人、猪HEVORF2抗体的交叉反应,使得血清学的调查一直处于初级阶段。禽HEVORF2基因序列同人、猪HEV的同源性为48-49％,其中ORF2蛋白中最保守的区域位于aa339-606。
　　 将本实验室保存的禽HEV ORF2-1重组质粒转入大肠杆菌原核表达禽HEV ORF2-1蛋白(aa339—564),经过提纯后免疫小鼠,经常规的细胞融合和亚克隆制备出6株禽HEV ORF2-1蛋白的单克隆抗体(7H12,3E8,185,1H5,3A1和6G8)。利用9段ORF2截短的蛋白(ORF2-1～9)和8个多肽,通过间接ELISA方法,确定6株单抗7H12,3E8,185,1H5,3A1和6G8分别识别aa339—355,aa355-384,aa355-384,aa384-414,aa389-398和aa510-516。3E8和185两株单抗识别同一抗原表位区aa355-383,但这一抗原表位区含有28aa,为了区别3E8和185,将3E8用HRP标记后做竞争ELISA,竞争ELISA结果显示3E8和185两株单抗识别两个不相互重叠的抗原表位。
　　 2009年,赵钦等从中国患有大肝大脾的鸡胆汁中首次分离出禽HEV,将中国株禽HEV攻毒SPF鸡,采集攻毒后粪便、血清等。利用6株单抗采用免疫捕获病毒方法去捕获攻毒后粪便中的禽HEV,其中7H12和1H5两株单抗可以捕获到病毒,进一步通过免疫组化实验证明7H12和1H5可以检测到攻毒鸡的器官中有禽HEV ORF2蛋白的存在。
　　 本实验制备出的6株单克隆抗体为研究禽、人和猪HEVs血清学调查提供了良好的物质基础。同时,7H12和1H5两株单抗可以捕获禽HEV病毒为禽HEV的确诊提供了理论依据。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

1 引言

1.1 戊型肝炎的概况

1.1.1 戊型肝炎病毒的病原学

1.1.2 戊型肝炎病毒的基因组结构

1.1.3 病毒的宿主范围与宿主

1.1.4 戊型肝炎的流行病学

1.1.5 检测方法

1.1.6 疫苗的研制

1.2 禽戊型肝炎病毒的研究进展

1.2.1 禽戊型肝炎病毒病原学

1.2.2 禽HEV肝炎病毒流行病学研究状况

1.2.3 禽戊型肝炎病毒免疫学的研究状况

1.3 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 载体

2.1.3 实验动物及病毒株

2.1.4 工具酶和主要试剂

2.1.5 主要仪器

2.1.6 溶液的配制

2.2 方法

2.2.1 禽HEV ORF2-1重组质粒的鉴定

2.2.2 禽HEV ORF2-1蛋白的表达和纯化

2.2.3 禽HEV ORF2s蛋白的设计、构建、表达、鉴定和纯化

2.2.4 小鼠的免疫

2.2.5 免疫小鼠抗体效价的测定

2.2.6 单克隆抗体的制备

2.2.7 单克隆抗体的鉴定

3 结果与分析

3.1 禽HEV ORF2-1重组质粒的鉴定

3.1.1 重组质粒禽HEV ORF2-1的酶切鉴定

3.1.2 重组质粒禽HEV ORF2-1基因测序

3.2 禽HEV ORF2-1蛋白的表达与鉴定

3.2.1 禽HEV ORF2-1蛋白的表达

3.2.2 禽HEV ORF2-1蛋白的Western blot鉴定

3.3 禽HEV ORF2s蛋白的设计

3.3.1 禽HEV ORF2-1蛋白的分析

3.3.2 禽HEV ORF2s引物的设计

3.4 禽HEV ORF2s蛋白的纯化和鉴定

3.4.1 禽HEV ORF2s蛋白纯化

3.4.2 禽HEV ORF2s纯化蛋白的鉴定

3.5 免疫小鼠抗体效价的测定

3.6 抗禽HEV ORF2-1蛋白特异性单克隆抗体细胞的筛选

3.7 单抗腹水的制备与纯化

3.7.1 单抗腹水的效价测定

3.7.2 单抗腹水的纯化

3.8 单克隆抗体的鉴定

3.8.1 单抗的特异性鉴定

3.8.2 单抗亚型的鉴定

3.8.3 单克隆抗体的功能鉴定

4 讨论

4.1 禽HEV ORF2s的表达和纯化

4.2 单克隆抗体的制备与鉴定

5 结论

6 参考文献

7 致谢

8 攻读学位期间发表论文情况