球毛壳ND35产次生代谢物的优化培养、理化性质及生物安全性

摘要

内生真菌是存在于植物体内和宿主之间具有共生关系的真菌，已在许多植物中发现。内生真菌存在于植物体内，能够产生次生代谢类物质、诱导植物产生系统抗性、促进植物生长、与病原菌竞争生态位点等多种拮抗机制抑制植物病害的发生，成为生物防治中重要的生防因子。
　　 为了在农业生产中应用无公害技术防治植物病害，本研究以杨树内生真菌球毛壳（Chaetomium globosum）ND35为供试菌株，采用L16（45）正交试验法对液体培养基进行优化；利用，pH纸色谱和捷克八溶剂系统纸色谱方法及紫外-可见光谱扫描法对次生代谢物进行了理化性质的初步分析；用薄层层析和高效液相色谱及平板抑菌法检测分析了粗提液中的活性成分和对杨树腐烂病菌的抑菌效果；还对球毛壳ND35产生次生代谢物液体培养的主要动力学指标进行了分析。结果表明：优化后培养基配方为：1％葡萄糖，1％蔗糖，0.5％牛肉膏，0.02％硫酸亚铁，0.01％维生素B1，pH值为7。球毛壳ND35的抑菌作用分为活菌体的抑菌作用和代谢活性物质的抑菌作用，液体培养后在胞内和胞外均产生了抗生物质，有较好的热稳定性。该物质pH值为中性，极性较弱，易溶于有机溶剂，难溶于水。紫外-可见光谱扫描可以确定：在221 nm处有最大的吸收峰，221 nm处的吸收值可以作为活性物质含量的指标。次生代谢物的薄层层析和高效液相色谱分析发现有4个组分对杨树腐烂病菌有抑菌活性。球毛壳ND35液体培养生长动力学表明，发酵过程中各指标是连续变化的。
　　 通过高效液相色谱检测，球毛壳ND35的粗提液中含有吲哚乙酸、赤霉素和麦角甾醇。经过多个生长指标测定发现，球毛壳ND35粗提液对菜豆有促生作用。浓度为1000μg/ml的球毛壳ND35粗提物对菜豆灰霉病的防治效果达到82.38％，浓度为1000μg/ml的ND35粗提液对菜豆立枯病的防治效果达到33.4％。球毛壳ND35粗提液诱导了菜豆体内防御酶活性和酚类物质的增加，ND35粗提液与菜豆灰霉病菌处理组的苯丙氨酸解氨酶（PAL）在第2 d达到最大比活，比活是1.1267 U·μg-1h-1；过氧化物酶（POD）在第8 d达到最大比活，其比活是9.4956 U·μg-1 min-1。多酚氧化酶（PPO）在第8 d达到最大比活，其比活是4.8506 U·μg-1 min-1。总酚含量第8 d达到最大值，最大值是308.93 OD280 g-1FW-1。
　　 球毛壳（C.globosum）ND35次生代谢物粗提物对植物生长性状的影响和子囊孢子在水中的存活、对植物根际土壤微生物的影响，以及对小白鼠和大白兔的毒性试验的研究结果表明，球毛壳ND35粗提物对黄瓜、菜豆和小麦的种子是安全的，并且能够显著增加须根数和根鲜重，促进种苗生长；对根际菌群体数量无显著影响；球毛壳ND35子囊孢子在水中能自行消解；对动物来说均属低毒级。因此，球毛壳菌ND35无毒、无污染，用于土传病害的生物防治无明显性风险。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略及中文对照表

1.内生真菌研究概况

1.1 内生真菌概念

1.2 内生真菌的多样性

1.3 内生菌的生物学作用

1.3.1 促进宿主植物的生长

1.3.2 提高宿主植物的抗病害能力

1.4 植物内生真菌次生代谢产物

1.5 球毛壳概述

1.6 球毛壳ND35概述

1.7 展望

1.8 本研究的目的与意义

2 试验内容

2.1 试验材料

2.1.1 供试菌种、作物

2.1.2 培养基和营养土

2.1.3 主要试剂及仪器

2.2 试验方法

2.2.1 次生代谢物的发酵培养和粗提取

2.2.2 正交试验设计优化培养基

2.2.3 抑菌活性物质的定位检测

2.2.4 次生代谢物鉴别和测定

2.2.5 次生代谢物液体培养的动力学分析

2.2.6 球毛壳ND35粗提液中吲哚乙酸的检测

2.2.7 球毛壳ND35粗提液中赤霉素的检测

2.2.8 球毛壳ND35粗提液中麦角甾醇的检测

2.2.9 球毛壳ND35粗提液对菜豆生长的影响

2.2.10 球毛壳ND35粗提液对菜豆立枯病的防治

2.2.11 球毛壳ND35粗提液诱导菜豆体内防御酶和酚类物质的变化

2.2.12 内生真菌球毛壳ND35的生物安全性评价

3结果与分析

3.1 培养基组成和发酵条件的正交试验设计和结果

3.2 抑菌活性物质的定位分析结果

3.3 次生代谢物鉴别和检测

3.3.1 捷克八溶剂系统测定结果

3.3.2 pH纸层析的测定结果

3.3.3 紫外-可见吸收光谱的扫描结果

3.3.4 次生代谢物的薄层和高效液相色谱分析

3.3.5 次生代谢物液体培养的动力学分析结果

3.3.6 球毛壳ND35粗提液中吲哚乙酸的检测结果

3.3.7 球毛壳ND35粗提液中赤霉素的检测结果

3.3.8 球毛壳ND35粗提液中麦角甾醇的检测

3.3.9 球毛壳ND35粗提液对菜豆的促生结果

3.3.10 球毛壳ND35粗提液对菜豆立枯病的防治

3.3.11 球毛壳ND35粗提液诱导菜豆防御酶和酚类物质的变化

3.3.12 内生真菌球毛壳ND35的生物安全性评价

4 讨论与分析

4.1 球毛壳ND35发酵产生次生代谢物条件的优化

4.2 球毛壳ND35发酵产生次生代谢物的性质

4.3 球毛壳ND35发酵产生次生代谢物的抑菌作用

4.4 球毛壳ND35次生代谢物诱导植物抗病性

4.5 球毛壳ND35次生代谢物对植物的促生作用

4.6 球毛壳ND35的生物安全性

5 结论

6.本论文的创新点：

参考文献

致 谢

研究生期间发表论文