嗜热毛壳菌热稳定β-1，3-葡聚糖酶的基因克隆、表达及性质研究

摘要

β-1，3-葡聚糖酶是一类能够特异作用于β-葡聚糖中β-1，3糖苷键的葡聚糖水解酶系。β-1，3-葡聚糖酶大体上可以分为两类：外切β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.58）和内切β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.6或EC3.2.1.39）。β-1，3-葡聚糖酶广泛分布和存在于病毒、细菌、丝状真菌、放射菌类、酵母、软体动物和高等植物中。在啤酒工业、饲料工业、医疗和植物抗病等方面有大量应用。
　　 嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）是一种广泛分布的嗜热真菌，其生长上限温度很高，产生的嗜热酶在高温条件下具有很高的活性和稳定性，该菌在含有麦麸的培养基中，50℃条件下可以产生β-1，3-葡聚糖酶。目前已从该菌中分离纯化了热稳定的蛋白酶、几丁质酶和纤维素酶等，但未见该菌β-1，3-葡聚糖酶的完整报道。
　　 本研究以嗜热毛壳菌为研究材料，根据已得到β-1，3-葡聚糖酶的中间片段，设计特异引物，通过RACE-PCR和热不对称交错PCR等方法，克隆了该β-1，3-葡聚糖酶的编码基因glu-n，全长cDNA2765bp，包含一个由786个氨基酸组成的开放阅读框。该基因cDNA已在GenBank中注册，登录号为GQ149728。
　　 glu-n基因和酵母分泌型表达载体pPIC9K用SnaBⅠ和AvrⅡ双酶切后体外连接，构建酵母重组表达载体pPIC9K/glu-n，将重组表达质粒pPIC9K/glu-n用限制性内切酶SacⅠ（位于5'AOX1区内）线性化后，采用电击法转化Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选得到多拷贝整合子，进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的蛋白的工程菌株。筛选到表达酶活性最高的菌株4-60，甲醇诱导7d酶活性达到最高，达257.379U/mL。
　　 表达的β-1，3-葡聚糖酶进行硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析获得了凝胶电泳均一的分子量约为94kDa的β-1，3-葡聚糖酶。表达β-1，3-葡聚糖酶GLU-N的最适反应温度和pH分别为60℃和5.0，70℃的保温60min仍具有60％的酶活性；在pH值为4.0～7.0之间保持稳定的酶活性。β-1，3-葡聚糖酶对轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioide）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）的菌丝生长有一定的抑制作用。对嘴突凸脐蠕孢（Exserohilum rostratum）孢子萌发有一定的抑制作用。4.5h抑制率可达50％。
　　 嗜热毛壳菌β-1，3-葡聚糖酶基因能在重组的毕赤酵母中分泌出具有生物活性的目的蛋白，而且表达产物有较好的热稳定性，这预示了重组GLU-N在生物学领域和工业的广阔应用前景。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词及中文对照表

1 引言

1.1 研究进展

1.1.1 β-1,3-葡聚糖酶的分类

1.1.2 β-1,3-葡聚糖酶的功能

1.1.3 β-1,3-葡聚糖酶的研究

1.1.4 β-1,3-葡聚糖酶的应用

1.2 嗜热微生物和高温酶

1.3 选题的目的意义、研究内容、技术路线

1.3.1 选题的目的意义

1.3.2 研究内容

1.3.3 技术路线

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 主要生化和分子生物学试剂、酶

2.1.4 仪器

2.1.5 培养基

2.1.6 溶液配制

2.2 嗜热毛壳菌热稳定β-1,3-葡聚糖酶cDNA基因的克隆及序列分析

2.2.1 PCR引物设计

2.2.2 嗜热毛壳菌总RNA的提取（Trizol法）

2.2.3 紫外检测RNA产率和纯度

2.2.4 反转录cDNA第一链的合成

2.2.5 目的基因3'末端的分离（3'-RACE）

2.2.6 β-1,3-葡聚糖酶基因DNA序列5'端序列的TAIL-PCR扩增

2.2.7 β-1,3-葡聚糖酶基因DNA与全长cDNA序列的克隆

2.2.8 β-1,3-葡聚糖酶基因全长序列的生物信息学分析

2.2.9 β-1,3-葡聚糖酶基因DNA序列分析

2.3 嗜热毛壳菌热稳定β-1,3-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

2.3.1 β-1,3-葡聚糖酶glu-n基因序列的克隆

2.3.2质粒提取

2.3.3质粒DNA的酶切鉴定

2.3.4序列测定

2.3.5 β-1,3-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

2.3.6线性化质粒DNA制备

2.3.7酵母转化（电击法）

2.3.8酵母转化子的筛选与鉴定

2.3.9外源基因多拷贝整合转化子筛选

2.3.10酵母工程菌的培养和β－1，3－葡聚糖酶的诱导分泌表达

2.3.11表达产物的生物学活性检测

2.3.12表达β－1，3－葡聚糖酶的SDS-PAGE分析

2.3.13表达β－1，3－葡聚糖酶工程菌产酶曲线的测定

2.4 巴斯德毕赤酵母分泌表达产物的纯化

2.4.1粗酶液的制备

2.4.2硫酸铵沉淀

2.4.3DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析

2.4.4 蛋白质分子量测定和纯度鉴定

2.4.5 蛋白质含量测定

2.5 表达β-1,3-葡聚糖酶酶学特性的研究

3 结果与分析

3.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因扩增模板的提取

3.1.1 嗜热毛壳菌总RNA的提取

3.1.2 嗜热毛壳菌基因组DNA的提取

3.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA与DNA序列的扩增

3.2.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因3'-末端cDNA的分离

3.2.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA 5'-末端的分离

3.2.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的分离及扩增片断的序列拼接

3.2.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶全长DNA的扩增

3.3 β-1,3-葡聚糖酶基因glu-n的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3.3.1 β-1,3-葡聚糖酶基因glu-n的核苷酸序列分析

3.3.2 β-1,3-葡聚糖酶基因glu-n的氨基酸序列分析

3.3.3 β-1,3-葡聚糖酶基因glu-n的结构域分析

3.3.4 β-1,3-葡聚糖酶转运分析

3.3.5 β-1,3-葡聚糖酶基因glu-n的氨基酸组成

3.3.6 β-1,3-葡聚糖酶基因glu-n结构及加工后的修饰分析

3.4 嗜热毛壳菌热稳定β-1,3-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

3.4.1 β-1,3-葡聚糖酶glu-n表达基因序列的限制性酶切位点分析结果

3.4.2 β-1,3-葡聚糖酶glu-n编码序列的分离

3.4.3 β-1,3-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

3.5 表达β-1,3-葡聚糖酶的纯化

3.5.1 DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析

3.5.2 β-1,3-葡聚糖酶分子量和纯度鉴定

3.6 表达β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

3.6.1 表达β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度

3.6.2 表达β-1,3-葡聚糖酶的最适反应pH值

3.6.3 表达β-1,3-葡聚糖酶的热稳定性

3.6.4 表达β-1,3-葡聚糖酶的pH值稳定性

3.6.5 表达β-1,3-葡聚糖酶对不同底物活性的测定

3.6.6 表达β-1,3-葡聚糖酶的抑菌活性测定

4 讨论

4.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的基因克隆

4.1.1 研究方法

4.1.2 β-1,3-葡聚糖酶基因glu-n的结构

4.1.3 β-1,3-葡聚糖酶基因glu-n的非编码区

4.2 重组β-1,3-葡聚糖酶在毕赤酵母中的表达

4.2.1 表达系统的选择

4.2.2 线性化的原因及不同线性化方式的影响

4.2.3 影响毕赤酵母高效表达的原因

4.2.4 蛋白的翻译及加工

4.3 重组β-1,3-葡聚糖酶的纯化和性质研究

4.3.1 β-1,3-葡聚糖酶的纯化

4.3.2 β-1,3-葡聚糖酶的稳定性

4.3.3 β-1,3-葡聚糖酶基因工程

5 结论和建议

5.1 结论

5.2 建议

6 参考文献

7 致谢