3个玉米自交系幼胚转化受体系统建立和CYP735A基因的农杆菌介导转化

摘要

玉米(Zea Mays L.)是重要的粮饲兼用作物，用基因工程方法将优良基因转入优良玉米自交系是当前玉米高产育种的重要途径之一。在玉米转基因研究中，建立高效、稳定的玉米遗传受体系统不仅是转化成功的重要前提，而且对提高转化细胞分化和再生转化苗获得率，对利用基因工程手段进行自交系的改良和应用具有重要意义。本研究以3个优良玉米自交系18-599、齐319和A188为转化受体试材，对幼胚转化受体系统的建立进行探索，研究了影响转化过程的多个因素，并用农杆菌介导法转化了CYP735A基因。获得的主要结论如下：
　　 1、幼胚取材时间(生理状态)和组培条件对愈伤诱导和植株再生有重要影响。取授粉后10～15 d的雌穗，幼胚长度1.6～2.0 mm，盾片向上摆放,25℃培养，幼胚膨大速度最快，形成的胚性愈伤多。高浓度的2,4-D(3.0 mg L-1)是诱导愈伤组织所必须的；在继代培养基中加2,4-D(3.0 mg L-1)+NAA(0.2 mg L-1)可以显著增加齐319和18-599的胚性愈伤组织的形成,2,4-D(3.0 mg L-1)+NAA(0 mg L-1)组合对A188的幼胚愈伤诱导效果最好，且都对生芽有较好的抑制作用。在分化培养过程中，1/2 MS培养基附加0.5 mg L-1激动素(KT)适合玉米分化生根；生根培养时，0.5 mg L-1的ABT可以促进再生芽生根，并可增加再生苗的生根数量。
　　 2、农杆菌介导转化影响因素的研究表明，不同基因型的转化条件存在差异，齐319和18-599在菌液OD600<0.4时浸染效果较好；A188浸染菌液OD600<0.2为宜；在浸染时间为10 min时，采用加滤纸20℃共培养3 d的方法更容易控制浸染过程，且利于提高T-DNA转移效率；在3轮筛选培养中，齐319和A188的巴龙霉素(PRM)适宜筛选浓度依次为80、100和80 mg L-1，18-599为100、120和100 mg L-1。
　　 3、用优化后的受体系统，采用农杆菌介导法对3个自交系进行CYP735A基因的转化，获得转化苗约300株，移栽成活率约为30％。针对转化植株的目的基因CYP735A和标记基因NPTⅡ进行PCR检测，共获得8株齐319转CYP735A基因阳性植株,4株18-599转基因阳性植株，其中有2株齐319经RT-PCR检测呈阳性，18-599也获得RT
　　 -PCR阳性植株3株。初步证实CYP735A和NPTⅡ基因已整合到玉米基因组中。
　　 4、玉米胚性愈伤组织的诱导受基因型及组培条件等多种因素影响。不同基因型的玉米幼胚的胚性愈伤组织诱导率之间存在很大差异，本研究所选用的3个玉米自交系中，18-599、齐319和A188的幼胚出愈率分别为94.5％、93.1％和85.2％，其中18-599和齐319的幼胚出愈率较高，且愈伤生长良好，是进行转基因研究的良好试材，而A188胚性愈伤组织诱导率最低，且所形成的愈伤颜色发白，不适于多次继代培养。

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1 引言

2 材料和方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

致 谢

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