桑树黄化型萎缩病植原体致病相关蛋白基因的克隆及致病性分析

摘要

植原体病害是世界性植物病害，桑黄化型萎缩病是由植原体引起的桑树重大病害，常导致大片桑树毁灭，严重制约了蚕桑业的发展。由于植原体分离、培养困难，植原体致病的分子机制目前仍不清楚。本研究利用基因同源克隆技术分离到桑树植原体致病相关蛋白基因MPEP和MDPH，对其编码蛋白进行了生物信息学分析，并初步探讨了其致病性，为从分子水平上揭示桑树植原体的致病机制奠定了基础，同时为植原体病害的防治技术研究提供了参考。
　　 1、利用同源克隆技术分离得到桑树黄化型萎缩病植原体效应蛋白MPEP基因(GenBank注册号：HM153427)，MPEP全长213bp，编码70个氨基酸；MPEP理论分子质量为8.19kDa，等电点为5.45，属酸性蛋白，其氨基酸序列与其他植原体中已分离的同源蛋白具有很高的同源性；结构预测分析表明：MPEP二级结构富含α-螺旋，其次是β-折叠，含有少量的无规卷曲和β-转角；MPEP的理化特征预测表明：该蛋白有明显信号肽序列和一个跨膜区，显示较强的亲水性，为分泌蛋白;将去掉终止密码子的MPEP编码框插入含GFP基因的原核穿梭表达载体pBBR1MCS-5，转化桑树内生枯草芽孢杆菌Lu-144，在Lu-144发酵液上清液中检测到GFP荧光信号，初步证实了MPEP的分泌性；将MPEP编码区插入原核表达载体pET30a(+)构建了原核表达载体pET30a-MPEP-GFP，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，MPEP在BL21菌株发酵液上清液中成功表达，进一步证实MPEP的分泌性；将不含终止密码子的MPEP编码框插入含GFP基因的植物表达载体pBI121，构建了MPEP-GFP的植物表达载体pBI121-MPEP-GFP，成功地转入拟南芥和洋葱表皮细胞，发现表达的MPEP蛋白定位于植物细胞质内；将MPEP编码区插入植物表达载体pBI121，构建了MPEP的植物表达载体pBI121-MPEP，成功地将MPEP基因转入拟南芥，通过对转基因植株表型和生理生化特征分析表明，MPEP表达可引起植株出现典型的植原体病害病症；通过GC-MS分析发现MPEP在拟南芥植株中表达引起拟南芥代谢组发生明显变化，其中糖类、有机酸类、氨基酸类、醇类和烃类等物质含量变化显著。本研究为深入探讨桑树植原体效应蛋白MPEP的致病性及植原体的致病机制奠定了基础。
　　 2、利用同源克隆技术克隆得到桑树黄化型萎缩病植原体溶血素蛋白基因MDPH(GenBank登录号：HQ891118)。MDPH全长717bp，编码238个氨基酸，蛋白质理论分子质量为27.3kDa，等电点为9.29，其氨基酸序列与其他植原体中已分离的溶血素蛋白有很高的同源性；MDPH的结构预测表明：该蛋白的二级结构富含α-螺旋，其次为β-折叠和无规卷曲，而转角仅占5.46％；蛋白质的理化特征预测表明：该蛋白具有多个亲水和疏水区域，且疏水性强于亲水性，易形成跨膜螺旋，具有7个显著跨膜结构区；蛋白的抗原性较强，不含有明显的信号肽序列；将MDPH编码区插入原核表达载体pET30a(+)，并转化到大肠杆菌菌株BL21中，经过IPTG诱导，MDPH在BL21菌株中成功表达；将MDPH编码区插入植物表达载体pBI121，转化农杆菌，侵染拟南芥，获得转基因植株，MDPH在拟南芥植株中表达可引发植株果荚变小，植株呈紫红色，茎秆坚韧性降低等表型。本研究为深入探讨桑树植原体溶血素蛋白MDPH的功能及其致病作用奠定了基础。