注射葡萄糖对罗非鱼糖代谢、胰岛素受体和GLUT4基因表达的影响

摘要

鱼类对碳水化合物的利用是有限的，越来越多的研究表明，鱼类的外周组织对糖的利用不足可能是其对糖不耐受的一个重要原因。现阶段关于这方面研究多集中于胰岛素受体(InsulinRecepror，IR)、葡萄糖转运蛋白(GLUTs)和糖代谢酶方面。本课题以吉富罗非鱼为研究对象，研究高浓度葡萄糖对血糖、胰岛素以及相关的两种糖酵解关键酶的影响。同时对吉富罗非鱼的IR-1和GLUT4的基因进行了克隆和序列分析，并研究了注射高浓度葡萄糖对这两种基因mRNA表达水平的影响，旨在探索鱼类对碳水化合物不耐受的原因，为阐明高糖水平对鱼类产生营养胁迫的生理机制提供基础资料。
　　 本课题选取体重约80g的吉富罗非鱼150尾，随机分成2个试验组。对照组腹腔注射0.7％的无菌生理盐水，处理组腹腔注射葡萄糖(30mg/100g体重)。在注射后的0h、1h、3h、6h和12h分别采取血液、肌肉、心脏和肝脏用于试验检测。
　　 研究注射葡萄糖对吉富罗非鱼血液生化指标、胰岛素和糖酵解酶的影响。结果表明：(1)吉富罗非鱼在注射葡萄糖后1h血糖达到最高水平，而后显著下降(P<0.05)，3h后恢复到正常水平；(2)肝糖原在葡萄糖注射后的6h达到最高水平，而后显著下降(P<0.05)，肌糖原变化不显著；(3)血浆和肌肉中的胰岛素均在葡萄糖注射后的3h达到最高水平，而后显著下降(P<0.05)，而肝脏中的胰岛素水平变化不显著；(4)丙酮酸激酶的活力在葡萄糖注射后6h达到最高水平(P<0.05)，己糖激酶的活力变化不显著。
　　 利用RT-PCR和RACE-PCR的方法从罗非鱼肌肉中克隆得到IR-1基因的片段，其GenBank注册号为JN967750,cDNA片段大小为1979bp，有548个氨基酸组成。序列分析发现，罗非鱼的IR-1基因与其他物种比较具有很高的保守性，并具有丰富的酪氨酸激酶特征性序列。通过半定量RT-PCR检测，比较IR-1基因的mRNA表达水平在肌肉、肝脏、心脏中的差异。结果显示，罗非鱼的IR-1基因的mRNA在肌肉、心脏和肝脏中均有较高的表达，其中肝脏中相对较低。在高浓度葡萄糖对IR-1基因的mRNA表达的影响试验中，结果显示，罗非鱼在葡萄糖注射后的12h内，心脏中的IR-1基因的mRNA的表达量没有显著变化，而在肌肉和肝脏中在葡萄糖注射后的6h，mRNA的表达量达到最高(P<0.05)，12h时恢复到正常水平。
　　 利用RT-PCR的方法从罗非鱼肌肉中克隆得到GLUT4的基因片段，其GenBank注册号为JN900493，cDNA片段大小为603bp，有200个氨基酸组成。序列分析发现，罗非鱼的GLUT4与其他物种比较具有很高的保守性，具有第一类别GLUT的保守序列，同时还具有和其他GLUTs一样的跨膜结合位点。通过半定量RT-PCR检测，比较GLUT4和GLUT2基因mRNA在这肌肉、心脏和肝脏三种组织的表达量，结果显示，GLUT4基因的mRNA在肌肉和心脏中获得了很高的表达量，而肝脏中GLUT4的表达量相对较低；GLUT2在肝脏中的表达量最高，而肌肉和心脏中表现出极低的表达量。在高浓度葡萄糖对GLUT4和GLUT2基因mRNA表达量的影响，试验结果显示，红肌GLUT4中的表达量在葡萄糖注射后的3h开始升高，在12h时达到最高水平(P<0.05)，心脏中的GLUT4在葡萄糖注射后的第1h显著性的升高(P<0.05)，而后随着时间的推移逐渐降低，在第6h时就恢复到了基础水平。肝脏中GLUT2基因mRNA表达水平没有显著差异。
　　 综上所述，注射葡萄糖显著提高了罗非鱼的血糖水平，且维持时间较长，而胰岛素水平、IR和GLUT4基因的mRNA表达量明显滞后于血糖水平的提高。而己糖激酶活力的不足又限制了葡萄糖的酵解反应，从而引起血浆胆固醇升高，并伴有持续的高血糖和肝糖原，产生了营养胁迫的生理反应，加重了鱼类对葡萄糖的代谢负担。胰岛素及其受体和GLUTs对于血糖反应的滞后性，以及表现出的不同步可能是罗非鱼对糖不耐受的重要原因。