鸭新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及应用

摘要

鸭新城疫是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起鸭的一种急性、高度接触性、败血性传染病，可造成鸭的大量死亡，使养鸭业损失严重。加强该病的诊断方法的研究对预防和控制鸭新城疫的发生，保护和促进养鸭业的健康发展具有重要意义。核衣壳蛋白(NP蛋白)是鸭新城疫病毒结构蛋白中含量最多、保守性高且具有免疫原性的一种蛋白。为此本研究构建了NP蛋白的原核表达载体并进行了诱导表达，对重组蛋白进行了免疫原性的鉴定，并以NP蛋白为免疫原，制备了NP蛋白的单克隆抗体，建立了以NP蛋白为包被抗原的间接ELISA方法，和检测抗鸭NDV的双抗体夹心ELISA方法。
　　 本研究根据GenBank发表的鸭NDVSDWF02株NP基因序列，设计并合成一对特异性引物，扩增出鸭新城疫病毒的NP基因，与原核表达载体pET-28a构建了重组质粒pET28a-NP。将测序正确的重组质粒转化至Rosetta感受态菌种，IPTG诱导后，SDS-PAGE分析表明，54KD的融合蛋白得以表达，主要以包含体形式存在。Western blot显示，该蛋白能与鸭新城疫的阳性血清发生特异性的反应，表明具有良好的免疫原性。
　　 用纯化后的重组蛋白为包被抗原，建立检测鸭新城疫抗体的间接ELISA方法，方阵滴定试验确定最佳包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，最佳包被浓度为10ng/well，血清最佳稀释度为1:1000。经应用试验表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性，为临床检测鸭新城疫抗体水平提供了一种简单、准确、快速的诊断方法。
　　 用纯化的鸭NDVNP蛋白作为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，通过淋巴细胞杂交瘤技术，经以重组NP蛋白为包被抗原的间接ELISA方法筛选，获得了2株能稳定分泌抗鸭NDVNP蛋白单抗的杂交瘤细胞株A1、B2。经ELISA检测A1、B2细胞上清效价均为为212，诱生的腹水的效价分别为107，106。Western blot和IFA显示，只有A1株能与病毒发生特异性反应。抗鸭NDVNP蛋白单克隆抗体的成功研制，为鸭NDV的免疫学诊断及致病机理的研究奠定基础。
　　 用纯化后的腹水A1为捕获抗体，抗鸭NDV多克隆抗体为第二抗体，建立了检测鸭NDV抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵滴定试验确定，单抗和多抗的最佳工作浓度分别为1:1600、1:1600,最佳包被液为CB。应用试验表明该方法具有良好的特异性和重复性，为建立准确、灵敏、易于普及的鸭NDV诊断试剂盒提供了理论基础。