烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建及其在交叉保护、外源蛋白表达及VIGS中的应用

摘要

植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒致病机理的重要工具。获得了侵染性cDNA克隆，可利用反向遗传学方法分析病毒基因在病毒复制、局部和系统移动、症状发展及病毒与寄主因子互作等过程中的作用，进而可以获得弱毒株系用来保护植物免受强毒株系的危害。植物病毒侵染性cDNA克隆也可以改造为超表达载体和病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)载体，可用来生产医用、兽用疫苗和抗体，也可用来研究植物基因功能。
　　 烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，可以由蚜虫以非持久性方式传播传播。近几年来，TVBMV在我国烟草上的发生呈上升趋势，给烟叶生产造成严重的经济损失。本研究获得了TVBMV侵染性cDNA克隆，验证了TVBMV弱毒突变体的交叉保护效果，并将TVBMV侵染性克隆改造为植物病毒超表达和VIGS载体。主要具体结果如下：
　　 (1)利用经典5'RACE获得了TVBMV HN39分离物的全长5'-UTR。TVBMV HN39的5'-UTR由171个核苷酸(nt)组成，包含多数马铃薯Y病毒属病毒包含的高度保守序列区域boxA(ACAACAU)和boxB(UCAAGCA)，比以前测定的多了25个nt。
　　 (2)构建了能分别用基因枪和农杆菌浸润接种的TVBMV侵染性克隆。在TVBMVHN39分离物的P3基因3’端、CI基因的5'端和3’端分别插入一个内含子，将其克隆到插入了35S启动子的pUC19载体上，获得质粒pTVBMV。利用基因枪将pTVBMV接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)、三生烟(N.tabacum cv.Samsun)和亮黄烟(N.rustica)，发病率为100％，说明pTVBMV有非常高的侵染性；pTVBMV在这三种寄主上的症状和病毒积累量均与野生型TVBMV一致。将携带内含子的TVBMV基因组克隆到质粒pCambia0390的SalⅠ和SmaⅠ之间，获得了能利用农杆菌浸润的侵染性克隆pCamTVBMV。通过融合PCR在TVBMVNIb和CP基因之间插入了GFP基因，得到pCamTVBMV-GFP；利用pCamTVBMV-GFP可在紫外灯下观察病毒在本氏烟中的移动。
　　 (3)利用TVBMV侵染性克隆pCamTVBMV-GFP分析了HC-Pro调控病毒致病力、抑制RNA沉默活性和协生的关键氨基酸位点。突变体IQI(IQC-IQI)、ART(NRT-ART)、R182I(FRNK-FINK)、D198K(CDN-CKN)和DEN(IQN-DEN)在本氏烟上的症状明显减轻，ELISA检测不到病毒的存在但荧光定量RT-PCR检测结果为阳性，说明该位点的突变影响了病毒的致病力、复制和翻译水平；突变体PAK(PTK-PAK)和APS(NPS-APS)引起的症状和野生型病毒一致，但症状出现的时间比野生型病毒的晚2天；而突变体EITC(RITC-EITC)、AGS(NGS-AGS)和SQN(IQN-SQN)对TVBMV的症状无影响，接种这三个突变体的本氏烟植株中病毒积累量与野生型病毒一致。农杆菌共浸润实验和协生实验表明，显著降低病毒致病力的5个突变位点基本丧失了RNA沉默抑制活性及与PVX的协生作用。这说明TVBMVHC-Pro的这些位点同时参与调控病毒的致病力、协生和抑制RNA沉默活性。
　　 (4)测定了含有单位点、双位点和三个位点突变的弱毒突变体的交叉保护效果，证明间隔期10天以上交叉保护效果更好。在本氏烟上，单个位点突变体DEN表现为轻微的花叶症状；双位点突变体DEN+D198K引起轻微的脉明症状；而三位点突变体DEN+D198K+ART无明显症状。交叉保护实验表明，接种双位点突变体DEN+D198K10天以后进行挑战接种交叉保护效果最好。
　　 (5)构建了TVBMV的超表达载体和VIGS载体。在pCamTVBMV衣壳蛋白(Coat protein，CP)基因上游和下游分别插入多克隆位点(MCS-1和MCS-2)，疫霉菌的Elicitin基因克隆到多克隆位点MCS-1，能够在注射区域观察到Elicitor引起的过敏性坏死反应(Hypersensitive reaction，HR)，说明该载体可用于外源蛋白的表达。在TVBMV弱毒株系DEN的CP基因上游和下游多克隆位点(MCS-1和MCS-2)，将其改造成VIGS载体。将GFP基因插入到TVBMVVIGS载体的多克隆位点MCS-1，在接种后第10天能够系统沉默16c的GFP基因，说明该载体可用于植物基因功能研究。