乙烯调控的生长素合成控制体细胞胚胎发生的分子机理

摘要

植物体细胞胚是从体细胞中诱导产生的形态上与合子胚相似的一种结构，体细胞胚发生体系是研究植物细胞全能性和植物早期胚胎发育的细胞学特征和分子机理的模式体系。在体细胞胚诱导过程中，去除培养基中的外源生长素，会引起胚性愈伤组织中生长素的极性运输以及响应信号的梯度分布发生改变，这对于体细胞胚胎发生是必需的。但是生长素的生物合成是否也参与了这个过程尚需研究。前人的研究证实，乙烯是调节体细胞胚胎发生及发育的重要激素之一，然而其中的分子机制尚不清楚。
　　 本文首先研究了生长素的生物合成在拟南芥体细胞胚胎发生过程中的作用;进而，分析了乙烯调控的生长素合成及响应信号的极性分布。研究结果为理解植物激素调节体细胞胚胎发生的分子机理提供了新的信息。主要研究结果如下:
　　 (1)体细胞胚胎发生需要YUCCA基因介导的生长素生物合成
　　 去除培养基中的外源生长素后，胚性愈伤组织中生长素合成关键酶基因YUCCA1（YUC1）、YUC2、YUC4和YUC6等基因的表达上调。与YUC基因的表达模式一致，生长素IAA的水平也是上升的。利用YUC基因的启动子驱动GUS报告基因，观察YUC基因的空间表达模式，发现诱导体细胞胚胎发生早期，GUS信号主要分布在胚性愈伤组织中体细胞胚即将发生的区域。遗传学分析证实，四突变体yuc1yuc4yuc10yuc11的体细胞胚诱导被明显抑制。上述结果说明YUC基因介导的生长素区域性合成对于体细胞胚胎发生是必需的。
　　 (2)体细胞胚胎发生过程中乙烯的合成下调
　　 通过对成熟胚性愈伤组织和诱导体细胞胚胎发生48小时的胚性愈伤组织进行转录组芯片比较分析，发现在诱导体细胞胚胎发生后，许多生长素响应基因的表达水平下调，然而YUC基因的表达水平却明显上调，进一步证明了内源生长素合成的上调。同时，乙烯合成的关键酶基区ACS2、ACS6和ACS8以及一些乙烯响应相关基因的表达水平下调。利用qRT-PCR进一步证实ACS基因的转录水平显著下调。乙烯释放速率分析结果显示，诱导体细胞胚胎发生的前48小时，乙烯的释放速率逐渐下降。上述结果说明，降低培养基中的外源生长素浓度导致AC基因介导的乙烯合成受到抑制。
　　 (3)乙烯负调节体细胞胚胎发生
　　 为了进一步研究乙烯在体细胞胚胎发生过程中的作用，我们通过在培养过程中施加乙烯合成前体ACC，提高胚性愈伤组织中内源乙烯的水平。结果显示体细胞胚胎发生受到抑制，并且这种抑制水平会随着施加ACC浓度的上升而逐渐增强。
　　 (4)过量乙烯通过抑制YUC介导的生长素合成负调节体细胞胚胎发生
　　 在培养基中施加200μM外源ACC后，在诱导体细胞胚胎发生的前48小时，YUC基因的转录水平明显下调。同时，YUC基因的表达在外源施加ACC后也由区域性分布变成了沿愈伤组织边缘分散而又微弱的分布，DR5rev∶∶GFP信号也发生了相应的变化。因此，外源施加ACC引起的过量乙烯释放，干扰了YUC基因介导的区域性生长素合成，破坏了体细胞胚胎发生所必需的生长素响应信号的极性分布，最终抑制了体细胞胚胎发生。
　　 与外源施加ACC类似，在乙烯过量合成突变体eto1-1中，体细胞胚胎发生频率明显降低，YUC4基因的转录水平相对于野生型也明显降低。此外，利用原位杂交技术分析发现，eto1-1突变体的愈伤组织中YUC4基因的区域性分布模式也被打乱，出现了沿愈伤组织边缘均匀分布的信号。说明ETO1基因突变后引起的乙烯过量合成通过干扰YUC基因介导的区域性生长素合成进而抑制了体细胞胚胎发生。
　　 为了分析乙烯信号转导在拟南芥体细胞胚胎发生过程中的作用，我们在实验中引入了组成型乙烯响应突变体ctr1-1。与野生型相比，ctr1-1突变体产生了严重异常的胚性愈伤组织，无法诱导产生体细胞胚。此外在ctr1-1突变体的愈伤组织中，YUC基因的表达水平明显降低。原位杂交实验结果显示，YUC4和YUC1的转录信号在突变体中改变了区域性分布的模式，并且杂交信号十分微弱。此外，DR5∶GUS信号的区域性表达模式在ctr1-1突变体中也同样被打乱。上述结果说明组成型的乙烯信号响应通过抑制YUC基因介导的生长素局部合成，最终干扰了生长素响应信号区域性分布的建立，从而抑制了体细胞胚胎发生。
　　 综上所述，拟南芥体细胞胚胎发生需要YUC基因介导的生长素的局部合成。去除培养基中的外源生长素后引起乙烯合成和信号转导的下调，这对于YUC基因介导的生长素区域性合成是必需的。过量乙烯通过抑制YUC基因的区域性合成，干扰生长素响应信号梯度分布的建立，最终将抑制体细胞胚胎发生。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 植物体细胞胚胎发生及其意义

1．1．1 植物细胞的全能性

1．1．2 体细胞胚胎发生的历史

1．1．3 体细胞胚胎发生的意义

1．2 植物体细胞胚胎发生的研究进展

1．2．1 体细胞胚的诱导过程及其特点

1．2．2 体细胞胚的形态发生

1．2．3 拟南芥体细胞胚胎发生过程中干细胞的形成

1．3 生长素对体细胞胚胎发生的调节作用

1．3．1 生长素的合成

1．3．2 生长素的运输及信号转导

1．3．3 生长素对拟南芥体细胞胚胎发生的调节作用

1．4 乙烯对植物生长发育的调节作用

1．4．1 乙烯的生物合成

1．4．2 乙烯的信号转导

1．4．3 生长素与乙烯的互作

1．4．4 乙烯对体细胞胚胎发生的调节作用

1．5 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株

2．1．3 生化试剂

2．2 实验方法

2．2．1 拟南芥的种植

2．2．2 拟南芥体细胞胚的诱导

2．2．3 植物组织总RNA的提取

2．2．4 反转录cDNA第一链的合成

2．2．5 实时定量PCR分析

2．2．6 植物基因组DNA的提取及纯化

2．2．7 PCR扩增

2．2．8 DNA序列测定

2．2．9 拟南芥突变体及转基因株系的鉴定

2．2．10 原位杂交分析

2．2．11 GUS染色分析

2．2．12 GUS染色后的石蜡切片

2．2．13 共聚焦显微镜观察和图像处理

2．2．14 愈伤组织中IAA水平的检测

2．2．15 愈伤组织中乙烯释放量的实时测定

2．2．16 基因芯片分析

2．2．17 化学试剂处理

3 结果与分析

3．1 YUC基因介导的生长素合成对于拟南芥体细胞胚胎发生是必需的

3．1．1 拟南芥体细胞胚胎发生体系

3．1．2 体细胞胚胎发生过程中YUC基因表达上调

3．1．3 体细胞胚胎发生过程中内源生长素含量上调

3．1．4 体细胞胚胎发生过程中YUC基因的时空表达模式

3．1．5 YUC基因的表达对于体细胞胚胎发生是必需的

3．2 体细胞胚胎发生过程中转录组结果分析

3．3 体细胞胚胎发生过程中乙烯合成下调

3．4 乙烯负调节体细胞胚胎发生

3．5 过量乙烯抑制了YUC基因的表达破坏了生长素的区域性分布

3．5．1 过量乙烯抑制了YUC基因的表达

3．5．2 过量乙烯破坏了生长素合成相关基因YUC的时空表达模式

3．5．3 过量乙烯破坏了生长素的响应模式

3．6 过量的内源乙烯合成通过抑制YUC基因的表达抑制体细胞胚胎发生

3．7 组成型乙烯信号转导通过抑制YUC基因的表达抑制体细胞胚胎发生

3．8 抑制乙烯的合成和信号转导并不影响体细胞胚胎发生

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况