烟草新病害—茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究

摘要

烟草是安徽省重要的经济作物，病害的发生一直是影响其优质稳产的重要限制因素。根茎类病害是影响烟草生长的一大类病害，尤其在多年连作影响下，根茎部病害对烟草生长和烟叶品质有极大的危害。安徽省烟草根茎部病害主要有青枯病、黑胫病、根黑腐病等。由于烟草连作，烟株根际附近微生物群落的演变更替，土传病害种类也逐年增加。2011-2012年我们在安徽省四个县采集病株和病田土壤，对皖南烟草产区发生的一种新的病害—烟草茎黑腐病病组织进行分离、纯化及病原鉴定。
　　由于烟草根茎类病害种类较多，且常常混合发生，给病害诊断造成较大困难，本研究利用分子检测方法对烟草根茎类病害进行检测，明确了安徽省烟区主要根茎病害种类，为烟草病害的防治提供理论依据，对烟草的稳产优质和持续发展具有重要意义。通过上述研究，结果如下:
　　1、对安徽省烟草主产区的烟草根茎病害进行了系统的调查与鉴定，描述了病害发生的症状和对烟草造成的危害。烟草茎黑腐病害的主要症状表现为烟草根茎部变黑，拔出感病烟株可见根部变黑腐烂，后期叶子变黄，萎蔫下垂，严重时整株枯死。
　　2、采用组织分离法对发病组织进行分离，获得175株真菌性分离物。通过在显微镜下观察分离物的孢子形态、颜色、产孢结构等，根据分离率的大小把分离物初步划分为三大类:一类为链格孢，另外两类为镰刀菌。
　　3、通过室内接种试验，确定病原菌。对编号为Mz01的致病菌株进行形态学及分子生物学检测，鉴定引起烟草茎黑腐病的病原为层出镰刀菌（Fusariumproliferatum）。
　　4、对编号为Mz01的致病菌株进行了生物学特性研究。Mz01菌株生长温度为12～32℃，最适生长温度为26℃，高于36℃则停止生长，在pH4.0～10.0均能生长，pH6为最适生长的酸碱度，最适生长碳源为蔗糖，氮源为甘氨酸，碳源对该菌营养生长的影响较为稳定，而氮源对其营养生长影响的变幅较大。
　　5、采用生长速率法测定了3-羟基-5-甲基异恶唑、多菌灵、甲基托布津和代森锰锌4种杀菌剂对致病菌株Mz01的室内抑菌效果，并对实验结果进行回归分析。结果表明，4种药剂对烟草茎黑腐病菌的EC50分别为0.2183、0.5124、5.4179和20.9545mg/L，EC90分别为1.2849、1.9912、221.2679和773.7263mg/L。根据EC50和EC90确定最好的两种用药为3-羟基-5-甲基异恶唑和多菌灵。
　　6、10种不同烟草品种的抗性研究结果表明，云烟97抗病性最好，病情指数为11.13，红花大金元病情指数最高，为97.72，其余8种抗病性由低到高依次为:K326、FL57、K346、云烟85、中烟100、6517、云烟87、碧翠一号。
　　7、采用分子生物学方法对采集的51份烟田土壤进行分子检测，检测结果表明，51份土样中层出镰刀菌的检测率为60.7％，烟草青枯病菌和根黑腐病菌检出比率分别为56.9％和41.2％，黑胫病菌检出比率为19.6％。其中部分烟田四种病菌都被检出，占总土样的5.9％。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 安徽烟草病害发生为害情况

1．2 烟草主要根茎类病害概况

1．2．1 烟草黑胫病

1．2．2 烟草青枯病

1．2．3 烟草根黑腐病

1．3 由镰刀菌引起的黑腐病病害

1．3．1 镰刀菌引起的烟草病害

1．3．2 层出镰刀菌引起的作物病害

1．4 镰刀菌属分类系统的发展

1．5 分子生物学方法在土壤检测应用

1．6 本课题研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 生化试剂和药品

2．1．2 供试菌株和植物

2．1．4 培养基的配制

2．1．5 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 烟草茎黑腐病株和烟田土样的采集

2．2．2 病原菌的分离

2．2．3 分离菌株的接种试验

2．2．4 病原菌鉴定

2．2．5 病原真菌生物学特性研究

2．2．6 不同药剂对病原菌菌丝生长的抑制作用

2．2．7 不同烟草品种抗性测定

2．2．8 土壤中病原菌的分子检测

3 结果与分析

3．1 田间病害调查

3．2 菌株的分离培养

3．3 分离菌株的接种试验

3．4 病原菌种的鉴定

3．4．1 病原菌的形态鉴定

3．4．2 病原菌的分子鉴定

3．5 病原菌的生物学特性

3．5．1 生长量测定

3．5．2 病原菌对碳、氮源的利用

3．5．3 温度对病原菌营养生长的影响

3．5．4 pH对病原菌营养生长的影响

3．6 病原菌的平皿药效试验

3．6．1 不同药剂对病原菌菌丝生长的抑制作用

3．6．2 四种杀菌剂的毒力比较

3．7 不同烟草品种抗性测定

3．8 土壤病原菌的分子检测

3．8．1 土壤中烟草层出镰刀菌的分子检测

3．8．2 土壤中烟草黑胫病菌的分子检测

3．8．3 土壤中烟草根黑腐病菌的分子检测

3．8．4 土壤中烟草青枯病菌的分子检测

3．8．5 51份土壤样品四种病原菌的检测结果

4 讨论

4．1 烟草茎黑腐病病原菌鉴定及其生物学特性研究

4．2 安徽省烟草根茎病害种类及分布

4．3 烟草根茎病害症状诊断的复杂性与问题

4．4 四种土传病原菌特异性引物的筛选

5 总结和展望

5．1 全文总结

5．2 特色与创新

5．3 研究展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况