昆虫抗冻蛋白的检测、功能鉴定及转基因应用

摘要

产生抗冻蛋白是昆虫重要的抗寒机制之一，昆虫抗冻蛋白的高活性决定了其有着广泛的应用前景，尤其是在抗寒转基因作物的培育方面有着重要的应用价值。在植物转基因技术日益成熟的今天，获得优质的抗冻蛋白基因资源显然已成为转基因育种能否成功的关键。本课题拟瞄准抗寒作物品种的培育，对寒冷地区昆虫进行了抗冻蛋白的检测，并尝试建立目的基因功能评价的原核表达体系和转基因操作，这些研究对更多优质昆虫抗冻基因的获得及其在转基因中的应用具有重要意义。现将主要研究内容和结果总结如下:
　　 1.寒冷地区昆虫抗冻蛋白的检测:首先，我们尝试通过差示扫描量热法检测昆虫总蛋白的热滞活性来判断抗冻蛋白的存在，并证明了这个方法是可行的。此后，在内蒙古大兴安岭林区采集到了7种越冬态昆虫，分别提取了它们的血淋巴或总蛋白，然后用差示扫描量热法分别进行了热滞活性检测，其中榆紫叶甲血淋巴中没有检测到热滞活性，表明它没有抗冻蛋白，而其他6种昆虫中均检测到了热滞活性，说明它们能够产生抗冻蛋白。在发现抗冻蛋白的6种昆虫中落叶松八齿小蠹(1.51～3.02℃)和云杉大墨天牛(1.28～2.60℃)的热滞活性较高，中带齿舟蛾(0.36～1.39℃)和落叶松鞘蛾(1.18～1.57℃)的抗冻活性居中，稠李巢蛾(0.34～0.43℃)和舞毒蛾(0.35～0.42℃)的热滞活性比较低。与检测到的黄粉虫的活性相比，都不如黄粉虫血淋巴的热滞活性(2.54～4.34℃)高，其中稠李巢蛾和舞毒蛾的活性跟黄粉虫总蛋白的活性(0.49～0.98℃)在同一个水平。
　　 2.黄粉虫抗冻蛋白的原核表达及活性检测:本研究成功构建出了黄粉虫抗冻蛋白基因的原核表达载体，通过诱导条件的摸索，成功诱导了融合蛋白的表达，并检测到了相应的活性。虽然融合蛋白的热滞活性较低(0.1 mg/mL的蛋白检测到的活性为0.47～0.62℃)，但是足以证明在转基因之前，通过原核表达进行目的基因的功能验证是可行的。
　　 3.黄粉虫抗冻蛋白转基因水稻的鉴定:利用基因枪法将克隆到的4个黄粉虫抗冻蛋白基因转到日本晴粳稻里，获得了长势良好的转基因植株，并利用PCR技术鉴定到了相当数量的阳性植株，4个基因的阳性植株概率都在60％以上。预期结果的实现，表明将黄粉虫抗冻蛋白基因转入水稻获得了初步成功，同时为下一步进行转基因水稻抗寒性的生测实验提供了基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 昆虫抗冻蛋白简介

1．2 昆虫抗冻蛋白的检测

1．2．1 热滞活性的测定方法

1．2．2 判断昆虫抗冻蛋白存在的方法

1．3 昆虫抗冻蛋白的分离纯化

1．3．1 昆虫抗冻蛋白分离纯化的来源材料

1．3．2 昆虫抗冻蛋白分离纯化的常用技术

1．4 昆虫抗冻蛋白的结构

1．5 昆虫抗冻蛋白的作用机制

1．6 昆虫抗冻蛋白活性的影响因素

1．6．1 抗冻蛋白的保守序列的长度

1．6．2 抗冻蛋白浓度的影响

1．6．3 活化蛋白与热滞活性的关系

1．6．4 抗冻蛋白活性增强剂

1．6．5 其他因素

1．7 昆虫抗冻蛋白的应用

1．8 研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 昆虫抗冻蛋白的检测

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 血淋巴和总蛋白的获取

2．1．3 试验仪器

2．1．4 差示扫描量热法

2．2 黄粉虫抗冻蛋白的原核表达及活性检测

2．2．1 技术路线

2．2．2 供试黄粉虫

2．2．3 查找目的基因

2．2．4 总RNA的提取及反转录

2．2．5 克隆目的基因

2．2．6 表达载体的构建

2．2．7 融合蛋白的诱导表达与鉴定

2．2．8 蛋白纯化

2．2．9 表达蛋白的热滞活性测定

2．3 转基因水稻的鉴定

2．3．1 水稻转基因

2．3．2 阳性植株的鉴定

3 结果与分析

3．1 昆虫抗冻蛋白的检测

3．1．1 牛血清蛋白的热滞活性检测

3．1．2 黄粉虫幼虫总蛋白的热滞活性检测

3．1．3 7种昆虫热滞活性的检测

3．2 黄粉虫抗冻蛋白的原核表达及活性检测

3．2．1 确定目的基因

3．2．2 黄粉虫总RNA的提取及反转录

3．2．3 目的片段扩增

3．2．4 原核表达质粒的鉴定

3．2．5 重组蛋白的检测

3．2．6 表达蛋白的热滞活性检测

3．3 转基因水稻的鉴定

3．3．1 转基因

3．3．2 阳性植株的鉴定

4 讨论

4．1 昆虫抗冻蛋白的检测

4．2 黄粉虫抗冻蛋白的原核表达及活性检测

4．3 转基因水稻的鉴定

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况