非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A蛋白羧基端在PRRSV感染Marc-145细胞中的作用

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染导致的一种急性传染病。该病能引起怀孕母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎，仔猪与育肥猪则表现为明显的呼吸道症状，仔猪断奶前死亡率增高。目前PRRS已经遍及全球主要养猪的国家和地区，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。
　　 PRRSV通过与细胞膜表面的特异性受体结合，利用细胞内吞作用感染易感细胞。现已报道的存在于Marc-145细胞上的PRRSV的受体有CD163和波形蛋白。CD163属于富含半胱氨酸超家族的清道夫受体蛋白，起协助PRRSV脱衣壳和将病毒基因组RNA释放到胞浆的作用。波形蛋白与其它中间细丝蛋白组成的多聚体可能参与PRRSV在细胞内的复制和转移。
　　 2008年，Zhou等用针对PRRSV GP5蛋白抗体的抗独特型抗体(Mab2-5G2)通过免疫共沉淀的方法从PAM和MA-104细胞中提取出一个分子量约230KD的可溶性蛋白，该蛋白为非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A，NMHCⅡ-A)。非肌肉肌球蛋白Ⅱ型(NMⅡ)广泛存在于生物细胞中，在整个细胞周期，包括细胞迁移、胞质分裂、细胞吸附和细胞形态变化等过程中发挥重要作用。最新的研究结果证明NMHCⅡ-A作为Ⅰ型单纯疱疹病毒进入易感细胞的功能性受体。本实验室前期研究证实NMHCⅡ-A蛋白的羧基端对PRRSV感染Marc-145细胞有阻断作用。
　　 为进一步验证NMHCⅡ-A在PRRSV感染Marc-145细胞中的作用，本研究以NMHCⅡ-A蛋白羧基端为研究对象，探究其与单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2的结合位点及其在PRRSV感染Marc-145细胞中的作用，进行了以下实验:
　　 第一:NMHCⅡ-A与Mab2-5G2结合位点的鉴定及各蛋白对PRRSV感染Mare-145细胞抑制作用的验证。首先对NMHCⅡ-A羧基端大小为310个氨基酸的蛋白(命名为PRA)进行分段表达和部分氨基酸的缺失表达，经Ⅰ-ELISA和Western blot鉴定NMHCⅡ-A与Mab2-5G2的结合域为aa1677-1713。通过PRA蛋白的进一步分段表达和氨基酸的定点突变确定aa1678，aa1682和aa1700为NMHCⅡ-A与Mab2-5G2的结合位点。在活细胞工作站实时观察各蛋白对细胞周期无影响的前提下，通过病毒中和实验(VirusNeutralization Test，VNT)和荧光聚焦中和实验(Fluorescence Focus Neutralization，FFN)验证了各蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用，荧光定量PCR检测细胞内NMHCⅡ-A和CD163 mRNA转录水平和Western blot检测细胞内NMHCⅡ-A和CD163蛋白表达水平。结果显示PRA蛋白及包含结合位点的蛋白有明显的抑制作用，而包含一个或不包含结合位点的蛋白抑制作用明显降低，并且蛋白对细胞内NMHCⅡ-A和CD163 mRNA转录水平和蛋白表达水平无影响。证明NMHCⅡ-A与Mab2-5G2的结合位点在PRRSV感染Marc-145细胞中发挥作用。
　　 第二-PRA蛋白的真核表达及对PRRSV感染的抑制作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达并纯化得到天然构象的PRA蛋白。PRA蛋白与Marc-145细胞特异性结合，将PRRSV的感染延迟24h并且感染96h时其CPE明显弱于对照细胞。在PRRSV感染24h时，PRA蛋白能使其感染效率降低60％。但真核表达的PRA蛋白不能完全抑制PRRSV的感染，推测其他相关因素，如与PRRSV细胞受体的相互作用相关。
　　 第三:鉴定PRA蛋白与Marc-145细胞内其它受体的相互作用。免疫共沉淀验证PRA蛋白与Marc-145细胞内NMHCⅡ-A和CD163相互作用，并且PRA的四段互不重叠的分段蛋白都可与NMHCⅡ-A和CD163相互作用。结果充分证明NMHCⅡ-A与CD163特异性结合。
　　 实验结果证明NMHCⅡ-A羧基端在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的重要作用，这为进一步研究PRRSV感染细胞的分子机制提供了一定的依据，也为进一步探求PRRS的防控提供了新的思路。

目录

声明

论文说明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 PRRSV病原学特征

1．2 PRRSV分子生物学特征

1．2．1 基因组结构

1．2．2 5’端非编码区(5’-UTR)

1．3 PRRSV蛋白组学特征

1．3．1 非结构蛋白

1．3．2 结构蛋白

1．4 PRRSV免疫学研究进展

1．4．1 体液免疫反应

1．4．2 细胞免疫反应

1．5 PRRSV的致病机制

1．6 PRRSV的预防及控制

1．7 PRRSV受体的研究进展

1．8 非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A

1．9 PRRSV与抗独特型抗体

1．9．1 抗独特型抗体概述

1．9．2 抗独特型抗体与疾病治疗

1．9．3 PRRSV与抗独特型抗体

1．10 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞及毒株

2．1．2 实验试剂及耗材

2．1．3 质粒及受体菌

2．1．4 主要试剂配制

2．1．5 主要设备及仪器

2．2 方法

2．2．1 截短和缺失蛋白的原核表达及纯化

2．2．2 PRA蛋白与Mab2-5G2结合域的鉴定

2．2．3 突变和截短蛋白的原核表达及纯化

2．2．4 PRA蛋白与Mab2-5G2结合位点的鉴定

2．2．5 截短、缺失和突变蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的影响

2．2．6 杆状病毒转移载体质粒pFastBac HTB-PRA的构建

2．2．7 重组杆粒Bacmid-PRA的构建

2．2．8 重组杆状病毒的构建及病毒滴度测定

2．2．9 重组PRA蛋白表达的鉴定

2．2．10 Ni柱纯化真核表达的重组PRA蛋白

2．2．11 IFA验证重组PRA蛋白与Marc-145细胞的相互作用

2．2．12 重组PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的影响

2．2．13 免疫共沉淀实验鉴定PRA蛋白与CD163的相互作用

3 结果与分析

3．1 截短、缺失和突变基因扩增结果

3．2 PCR鉴定重组质粒

3．3 SDS-PAGE鉴定截短、缺失和突变蛋白的表达和纯化结果

3．4 Ⅰ-ELISA鉴定截短、缺失和突变蛋白的表达

3．5 Western Blot鉴定NMHCⅡ-A与Mab2-5G2的结合域和结合位点

3．6 Ⅰ-ELISA鉴定NMHCⅡ-A与Mab2-5G2的结合域和结合位点

3．7 IFA鉴定截短、缺失和突变蛋白与Marc-145细胞的结合

3．8 活细胞工作站实时观察截短、缺失和突变蛋白对Marc-145细胞正常细胞周期的影响

3．9 VNT检测截短、缺失和突变蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用

3．10 FFN检测截短、缺失和突变蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用

3．11 荧光定量PCR检测截短、缺失和突变蛋白对Marc-145细胞内NMHCⅡA和CD163 mRNA的相对转录水平的影响

3．12 Western Blot检测截短、缺失和突变蛋白对Marc-145细胞内NMHCⅡA和CD163蛋白表达水平的影响

3．13 PCR扩增PRA基因

3．14 转移载体质粒pFastBac HTB-PRA的酶切和PCR鉴定

3．15 重组杆粒Bacmid-PRA的PCR鉴定

3．16 真核重组PRA蛋白的鉴定及表达条件优化

3．17 病毒滴度测定

3．18 IFA验证真核重组PRA蛋白与Marc-145细胞的相互作用

3．19 SDS-PAGE和Western Blot检测纯化的真核PRA蛋白

3．20 真核重组PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的影响

3．20．1 病毒中和试验(VNT)检测真核重组PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用

3．20．2 荧光聚焦中和试验(FFN)检测真核重组PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用

3．21 免疫共沉淀实验鉴定结果

4 讨论

4．1 NMHCⅡ-A与Mab2-5G2的结合域及结合位点的鉴定

4．2 截短、缺失和突变蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞抑制作用的探究

4．3 PRA蛋白的真核表达及对PRRSV感染的抑制作用

4．4 PRA蛋白与Marc-145细胞内PRRSV受体相互作用探究

5 结论

参考文献

致谢

硕士在读期间发表论文情况